目的:研究抗纤维化四肽N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（Ac-SDKP）对矽肺大鼠纤维化肺组织中磷酸化热休克蛋白27（P-HSP27）及锌指家族核转录因子1（SNAI1）表达的调控，以探讨Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用。方法:于2014年12月，采用一次性支气管灌注二氧化硅（SiO 2）粉尘的方法制备大鼠矽肺动物模型，选取80只SPF级健康成年Wistar大鼠，根据随机数字表法将大鼠分为8组，每组10只。模型对照4周组（饲养4周）、模型对照8周组（饲养8周）：支气管灌注生理盐水1.0 ml/只；矽肺模型4周组（饲养4周）、矽肺模型8周组（饲养8周）：支气管灌注50 mg/ml的SiO 2混悬液1.0 ml/只；单独Ac-SDKP给药4周组（饲养4周）、单独Ac-SDKP给药8周组（饲养8周）：Ac-SDKP 800 μg·kg -1·d -1腹腔泵给药；Ac-SDKP预防治疗组：Ac-SDKP 800 μg·kg -1·d -1给药48 h后，支气管灌注SiO 2混悬液1.0 ml/只，饲养8周；Ac-SDKP抗纤维化治疗组：支气管灌注SiO 2混悬液1.0 ml/只4周后，给予Ac-SDKP 800 μg·kg -1·d -1治疗4周。蛋白免疫印迹（Western blotting）检测各组P-HSP27、SNAI1、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达，免疫组织化学技术检测P-HSP27和SNAI1的表达，激光共聚焦显微镜检测P-HSP27和α-SMA共定位表达。 结果:与模型对照组比较，矽肺模型组大鼠矽肺纤维化区域P-HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达增强，差异均有统计学意义（ P<0.05）。给予Ac-SDKP干预后，与矽肺模型8周组比较，Ac-SDKP预防和抗纤维化治疗组大鼠P-HSP27、SNAI1、α-SMAⅠ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（ P<0.05）。而单独Ac-SDKP给药组与模型对照组P-HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达无明显变化，差异均无统计学意义（ P>0.05）。激光共聚焦结果显示，矽肺模型组大鼠肺组织表达P-HSP27和α-SMA的阳性细胞多于模型对照组；与矽肺模型组比较，Ac-SDKP预防和抗纤维化治疗组表达P-HSP27和α-SMA的阳性细胞减少；与模型对照8周组比较，矽肺模型8周组结节中有部分P-HSP27和α-SMA表达的双阳性细胞。 结论:Ac-SDKP可能通过调节P-HSP27/SNAI1通路发挥抗矽肺纤维化的作用。

目的:构建人干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)沉默子的荧光素酶报告质粒，在人胚肾细胞(HEK293T)和人类宫颈癌细胞(HeLa)中检测荧光素酶活性，生物信息学预测其可能结合的转录因子并通过实验验证。方法:通过PCR扩增人STING-5-1a(-124～+267，相对于转录起始位点，TSS: 0)和STING-5-2a(-124～+168)区域，亚克隆至pGL3-Basic质粒；将人STING沉默子区域STING-5-1b(+169～+267)正向反向亚克隆至pGL3-Control质粒(pGL3-C-5-1b-positive/negative)，并把STING-5-1b分为两段互补片段，亚克隆至pGL3-Control载体上，命名为pGL3-C-STING-5-1b-α(+169～+209)/pGL3-C-STING-5-1b-β(+210～+267)，双荧光素酶报告活性分析检测上述重组质粒在HEK293T和HeLa中的活性。应用生物信息学方法预测人STING沉默子的转录因子结合位点，将预测结合位点进行多点突变，检测荧光素酶活性。敲低转录因子，免疫印迹试验检测STING的表达水平。染色体免疫共沉淀反应进一步验证转录因子与人STING沉默子的结合。结果:核酸测序证实，上述重组质粒构建成功。截短STING-5-1b(+169～+267)片段后相对荧光素酶活性上升。同时，与pGL3-Control质粒相比，pGL3-C-5-1b-positive重组质粒的相对荧光素酶活性下降( P<0.05)，其中，STING-5-1b-β(+210～+267)序列起主要抑制作用。应用生物信息学软件预测发现转录因子PR结构域锌指蛋白4(PRDM4)、Thanatos相关蛋白1(THAP1)、TEA域转录因子1(TEAD1)、核受体亚家族4 A组成员1(NR4A1)、类Krueppel因子4(KLF4)和叉头转录蛋白O3(FOXO3)可能与人STING沉默子区域(+210～+267)结合。对上述转录因子的结合位点进行多点突变构建突变体并转染至HEK293T和HeLa，发现THAP1-Mut和TEAD1-Mut的相对荧光素酶活性显著上升，提示STING沉默子可能含有THAP1和TEAD1的结合位点。将转录因子THAP1和TEAD1敲低后，STING的表达水平有显著上升。染色体免疫共沉淀试验表明，转录因子TEAD1和THAP1在细胞内与人STING沉默子区域结合。 结论:本实验成功构建了人STING沉默子荧光素酶报告质粒，通过活性比较，推测人STING的核心沉默子区位于+210～+267区域，通过生物信息学分析及点突变实验初步确定人STING沉默子可能含有的潜在转录因子结合位点。并使用免疫印迹试验和染色体免疫共沉淀进一步证实转录因子TEAD1和THAP1与人STING沉默子的结合，为后续研究提供实验资料。

目的:研究驻景丸加减方含药血清对过氧化氢(H 2O 2)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE)-19细胞上皮－间质转化(EMT)的作用及其机制。 方法:选取2月龄SPF级雌性SD大鼠30只，采用随机数字表法将其随机分为空白对照组和驻景丸加减方组，每组15只，分别给予生理盐水和驻景丸加减方连续灌胃7 d，以制备空白血清和含药血清。采用SD大鼠制备驻景丸加减方含药血清。将ARPE-19细胞分为正常对照组，模型对照组，空白血清组，2.5%、5.0%、10.0%含药血清组，SB216763组和SB216763+含药血清组；其中前2个组均于正常培养基中培养，后6个组分别于含空白大鼠血清培养基、相应浓度含药血清培养基、10 μmol/L GSK-3抑制剂SB216763培养基以及10 μmol/L SB216763+10.0%的含药血清培养基中培养；正常对照组常规培养，其他各组先常规培养24 h，后加入终浓度200 μmol/L的H 2O 2继续培养24 h。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活性；Transwell法检测细胞迁移能力；DCFH-DA法检测细胞内活性氧簇(ROS)含量；硫化巴比妥酸法检测细胞内丙二醛(MDA)含量；Western blot法检测细胞中Nrf2通路相关蛋白核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)和EMT相关蛋白转化生长因子β2(TGF-β2)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、snail家族锌指转录因子1(SNAIL1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。 结果:空白血清组、2.5%、5.0%、10.0%组细胞存活率总体比较差异无统计学意义( F＝0.163， P>0.05)。正常对照组、模型对照组、2.5%含药血清组、5.0%含药血清组、10.0%含药血清组细胞存活率分别为(100.50±5.91)%、(60.87±4.30)%、(73.27±4.46)%、(80.73±5.67)%和(89.90±4.97)%，正常对照组、模型对照组、空白血清组、2.5%含药血清组、5.0%含药血清组和10.0%含药血清组细胞迁移数分别为(84.67±8.33)、(222.33±13.58)、(215.67±10.02)、(174.67±10.60)、(143.67±8.02)和(107.67±6.66)个/视野，总体比较差异均有统计学意义( F＝26.628、99.289，均 P<0.01)。模型对照组细胞内ROS和MDA含量较正常对照组显著增加，差异均有统计学意义(均 P<0.01)；各含药血清组细胞内ROS和MDA含量均较模型对照组显著减少，差异均有统计学意义(均 P<0.01)。模型对照组细胞内SNAIL1、α-SMA、TGF-β2、p-AKT及p-GSK-3β蛋白相对表达量明显多于正常对照组和各浓度含药血清组，E-cadherin蛋白相对表达量明显少于正常对照组和各浓度含药血清组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与正常对照组比，模型对照组细胞质Nrf2蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与模型对照组比，各含药血清组细胞质Nrf2蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均 P<0.01)。与模型对照组相比，SB216763组细胞质Nrf2蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与SB216763组相比，SB216763+含药血清组细胞质Nrf2、SNAIL1和α-SMA蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2和E-cadherin蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:驻景丸加减方含药血清抑制H 2O 2诱导的ARPE-19细胞EMT，可能与AKT/GSK-3β通路的抑制及Nrf2信号通路的激活有关。

[目的]WRKY转录因子参与植物对低磷胁迫反应的调控.基于前期苦荞在低磷胁迫下的转录组数据,克隆FtWRKY28基因,预测基因及其编码蛋白的序列结构特征,分析基因在各器官中以及在低磷和激素处理下的表达模式、蛋白的亚细胞定位与转录激活活性,为阐明基因的生物学功能奠定基础.[方法]基于苦荞基因组数据库注释设计特异引物,用逆转录PCR从低磷处理的苦荞根RNA样中克隆FtWRKY28的完整编码序列,用生物信息学方法分析基因与蛋白的结构以及同源蛋白的进化关系,用实时荧光定量分析基因的表达模式,用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析蛋白的亚细胞定位,用酵母单杂交分析蛋白的转录激活活性.[结果]FtWRKY28的完整编码序列长876 bp,编码1个含291个氨基酸、有1个WRKY结构域、锌指结构域为C2 H2型的蛋白,归属WRKY家族Ⅱ组.FtWRKY28绝大部分定位于细胞核,具有转录激活活性.FtWRKY28在根中表达水平最高,受低磷、吲哚乙酸、赤霉素3和6-苄氨基嘌呤显著诱导.[结论]FtWRKY28具有转录因子的基本结构与生物化学特征,可能通过生长素、赤霉素、细胞分裂素信号网络的交互作用,调控苦荞在低磷胁迫下的响应过程.

目的 探讨锚蛋白重复序列和细胞因子信号传导抑制因子盒蛋白13(ASB13)在动脉粥样硬化(AS)进展中的作用和分子机制.方法 将载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠随机分为对照组、AS组、sh-NC组、sh-ASB13组和sh-ASB13+sh-锌指家族核转录因子2(SNAI2)组.对照组小鼠给予标准饮食,其余4组均给予高脂饮食,饲喂8周.细胞实验1将HUVECs分为细胞对照组、ox-LDL 组、ox-LDL+si-NC 组、ox-LDL+si-ASB13 组和 ox-LDL+si-ASB13+Erastin 组.细胞实验2 将 HUVECs 分为 ox-LDL+si-NC 组、ox-LDL+si-SNAI2 组和 ox-LDL+si-ASB13+si-SNAI2组.采用HE染色评估组织病理学变化;采用CCK-8分析细胞活力;采用Western blot检测ASB13、SNAI2、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、GPX4蛋白表达水平;采用生化检测试剂盒检测脂质代谢物和Fe2+水平.结果 动物实验结果表明,与对照组比较,AS组小鼠血清HDL-C水平及主动脉组织中SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均降低,LDL-C、TC、TG、Glu和Fe2+水平及主动脉组织中ASB13蛋白表达水平均升高(P＜0.05).与sh-NC组比较,ASB13敲低抑制AS小鼠的动脉粥样硬化斑块形成,SNAI2敲低则作用相反.细胞实验结果表明,与细胞对照组比较,ox-LDL处理降低HUVECs细胞活力,升高ASB13蛋白表达水平,促进脂质积累和铁死亡;沉默ASB13升高细胞活力,减少脂质积累和铁死亡(P＜0.05).ASB13泛素化降低SNAI2蛋白表达水平,SNAI2与SLC7A11启动子结合促进其转录激活,上调SLC7A11蛋白表达水平.与ox-LDL+si-NC组比较,沉默SNAI2或铁死亡诱导剂Erastin处理逆转了ASB13沉默对HUVECs的保护作用(P＜0.05).结论 ASB13可能通过SNAI2/SLC7A11介导的铁死亡促进AS发生与发展.

目的:探讨生理性拉应力对软骨细胞分化的调控作用,并阐明其相关信号通路机制.方法:体外培养软骨ATDC5细胞,应用四点弯曲细胞力学加载仪对其施加生理性拉应力,首先分为对照组和拉应力组(2 000 μstrain/2 h组),另分为不同力值(1 000、2 000和3 000 μstrain)加力时间为2 h和力值为2 000 μstrain不同加力时间(1、2和4 h)组,同时设未加力的细胞为对照组,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞中Ⅱ型胶原(Col-Ⅱ)、Ⅹ型胶原(Col-Ⅹ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、性别决定区Y框蛋白9(SOX9)、血管内皮生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Nel样1型分子(Nell-1)、Runt相关转录因子2(Runx2)、印度刺猬因子(Ihh)、补缀同源物1(Ptch-1)、GLI家族锌指蛋白1(Gli-1)和刺猬因子相互作用蛋白1(Hhip-1)mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中Nell-1、Runx2和Ihh蛋白表达水平.ATDC5细胞分为对照组、环巴胺组、拉应力组和环巴胺+拉应力组,采用 RT-qPCR法检测各组细胞中 Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平,采用Western blotting法检测各组细胞中 Nell-1和Ihh蛋白表达水平.结果:与对照组比较,2 000 μstrain/2 h组细胞中Col-Ⅱ、Col-Ⅹ、Aggrecan、SOX9、VEGF和PCNA mRNA表达水平均明显升高(P<0.01).在对细胞施加2 000 μstrain不同加力时间(1、2和4 h)或不同力值(1 000、2 000和3 000 μstrain)2 h的拉应力后,与对照组比较,随时间的延长或力值的增加其他各组细胞中Runx2 mRNA表达水平逐渐升高(P<0.01),Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1 和Hhip-1 mRNA表达水平逐渐升高(P<0.01),且在2 000 μstrain/2 h时达到最高,随后出现回落但仍明显高于对照组(P<0.01).Western blotting检测,各组细胞中Nell-1、Runx2和Ihh蛋白表达水平与mRNA表达水平变化趋势一致.环巴胺预处理后,与对照组比较,环巴胺组细胞中Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平均明显降低(P<0.01),拉应力组和环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与环巴胺组比较,环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与拉应力组比较,环巴胺+拉应力组细胞中Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01).与对照组比较,环巴胺组细胞中Ihh蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Nell-1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),拉应力组和环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1 和Ihh蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与环巴胺组比较,拉应力组和环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1和Ihh蛋白表达水平明显升高(P<0.01);与拉应力组比较,环巴胺+拉应力组细胞中Nell-1和Ihh蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05).结论:在生理性拉应力刺激下,Nell-1可在上游激活Ihh信号通路,进而调控ATDC5软骨细胞的分化.

目的:探讨积雪草酸对大鼠绝经后骨质疏松症(OP)的治疗作用及相关机制.方法:采用一次性手术摘除双侧卵巢方式构建绝经后 OP大鼠模型,分为模型组(9 只)、雌二醇组(10 只)、积雪草酸低剂量组(10 只)、积雪草酸中剂量组(10 只)和积雪草酸高剂量组(10 只).另取 9 只大鼠作为假手术组.观察骨组织病理改变、骨密度及微结构,以及血清骨代谢指标、骨代谢相关基因及蛋白表达.结果:雌二醇组和积雪草酸低、中、高剂量组均可减轻骨组织病理改变,增加骨密度,改善骨微结构.与假手术组比较,模型组大鼠股骨骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)下降,结构模式指数(SMI)和骨小梁分离度(Tb.Sp)上升,血清骨碱性磷酸酶(BALP)水平下降,Ⅰ型胶原交联氨基端肽(NTX-Ⅰ)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平上升,骨组织音猬因子(SH H)、细胞表面跨膜蛋白Patched1(Ptc1)、7 次跨膜蛋白(Smo)、Gli家族锌指蛋白-1(Gli1)、矮小相关转录因子2(Runx2)、骨保护素(OPG)、成骨细胞特异性转录因子(Osx)mRNA 和蛋白表达下降,细胞核因子-κB受体活化因子(RANKL)mRNA和蛋白表达上升(均P<0.05).与模型组比较,雌二醇组和积雪草酸低、中、高剂量组大鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th上升,SMI和Tb.Sp下降,血清BALP水平上升,NTX-Ⅰ和TRAP水平下降,骨组织 SHH、Ptc1、Smo、Gli1、Runx2、OPG、Osx mRNA 和蛋白表达上升,RANKL mRNA 和蛋白表达下降(均 P<0.05).雌二醇组和积雪草酸低剂量组上述指标比较差异无统计学意义(均P>0.05).积雪草酸低、中、高剂量组上述指标呈剂量依赖性(均P<0.05).结论:积雪草酸可治疗绝经后 OP,可能与激活 Hedgehog信号通路相关.

为了解西葫芦(Cucurbita pepo)的WRKY2的功能,通过转录组测序技术从叶片中分离到1条长度为1 071 bp的cDNA,并对其进行序列分析.结果表明,该序列包含 1 个 840 bp 的开放读码框,预测编码 279 个氨基酸,与中国南瓜(Cucurbita moschata,XM_023091218.1)的WRKY核苷酸序列相似性为98.51%,命名为CpWRKY2(GenBank登录号:XM_023676898.1).CpWRKY2定位于细胞核内,CpWRKY2 蛋白包含有1 个保守的WRKY结构域(第201～267位),206～266位为WRKY蛋白DNA结合区域,锌指结构域(第232～264位)为C2H2型,且含有1个保守RTGHARFRRAP(第76～86 位)氨基酸序列,属于典型的Ⅱd亚类WRKY家族蛋白.CpWRKY2基因上游启动子区域(ATG前的1 513 bp的序列)含有ARE、ABRE、MBS、TC-rich repeat和W-box等可能的胁迫响应顺式作用调控元件.CpWRKY2具有组织表达特异性,在花中表达量最高,其次为根和茎,在叶片和果实中的表达量较低.经5℃、10%PEG 6000模拟干旱胁迫,0.1 mmol/L ABA、50 mmol/L ETH、10 mmol/L SA和50 mmol/L MeJA处理后叶片中CpWRKY2均出现上调表达,因此,推测CpWRKY2基因参与了西葫芦不同非生物胁迫的防御反应.

Kruppel样因子(Kruppel-like factor,KLF)家族是一类广泛存在于生物体内的具有锌指结构的转录因子蛋白,可以结合到目的DNA上,在细胞分化和增殖方面进行转录调节[1].KLF家族共有17个因子,按照发现的时间分别命名为KLF1～l7.KLF因子C-末端含有3个高度保守的Cys2/His2锌指结构,优先结合富含GC核苷酸的靶序列或CACCC片段,而KLF因子N-末端结构的不同导致功能也不尽相同[2].已有研究报道,KLF家族成员与许多肿瘤的发生相关,例如KLF2与结肠癌[3]、乳腺癌[4],KLF5与食管癌[5],KLF10与胰腺癌[6].通过综述文献我们发现KLF家族中5个因子(KLF2、KLF 4、KLF 5、KLF 6和KLF 8)与泌尿系肿瘤关系密切,本文就KLF与泌尿系肿瘤相关性的研究现状综述如下.

玉米是我国第一大作物,提高玉米的抗逆性是玉米育种的重要目标性状之一.植物C2H2型锌指蛋白广泛参与植物各个时期的生长发育及逆境应答过程.本研究从玉米中分离了转录因子ZmC2H2-1基因并对其功能进行了初步研究.结果表明,ZmC2H2-1属于C2H2锌指蛋白转录因子家族,编码蛋白主要位于细胞核中,酵母自激活实验表明ZmC2H2-1不具有自激活活性;干旱、盐和ABA等逆境可抑制ZmC2H2-1基因在玉米中的表达;过表达ZmC2H2-1基因的拟南芥叶片失水速率更快,在PEG、高盐和ABA处理条件下,与对照相比转ZmC2H2-1基因拟南芥耐逆性降低,以上结果说明ZmC2H2-1基因是作为玉米抗逆的负调控因子参与了逆境胁迫应答.本研究为深入解析玉米ZmC2H2-1的调控网络和玉米的抗逆调控机制奠定了基础.