目的:探讨香烟烟雾提取物(CSE)对肺泡巨噬细胞(AMs)Dectin-1受体表达及对烟曲霉感染应答能力的影响。方法:实验研究。大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383加入CSE后再使用烟曲霉静止期孢子(RC)刺激以建立烟曲霉体外感染细胞模型，流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、蛋白质印迹检测Dectin-1表达；siRNA沉默和慢病毒载体过表达Dectin-1后通过吞噬实验检测AMs对RC吞噬能力，定量实时聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验检测相关细胞因子表达。结果:激光共聚焦显微镜(15.29±2.88比24.56±4.01， t＝11.75， P<0.05)及流式细胞仪(17.73±4.95比25.94±7.12， t＝17.27， P<0.05)均显示CSE降低AMs表面Dectin-1受体的表达。RC体外刺激后Dectin-1 mRNA的表达出现时间依赖性增加，对照组在所有时间点都较CSE组显著增加( P值均<0.05)；蛋白表达结果类似：对照组明显高于CSE组(18 h：0.755±0.035比0.360±0.047；24 h：0.968±0.035比0.552±0.049， P值均<0.05)。CSE降低AMs对RC吞噬能力(吞噬率：53.33%±9.95%比75.17%±8.66%；吞噬指数：2.17±0.58比7.67±1.53， P值均<0.05)。siRNA下调Dectin-1表达联合CSE可以进一步降低NR8383细胞对RC的吞噬力( P<0.05)，但单纯下调Dectin-1表达对RC的吞噬能力差异无统计学意义( P>0.05)。Dectin-1介导细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-4的产生：TNF-α、IL-1β在对照组增加尤为明显，感染6 h后达峰值，每个时间点比较差异均有统计学意义( P值均<0.05)。与之相反，IL-4在CSE组升高更为显著，每个时间点比较差异均有统计学意义( P值均<0.05)。IL-10表达也增加，但2组间比较差异无统计学意义( P>0.05)。使用siRNA抑制/慢病毒过表达Dectin-1对4种细胞因子mRNA和蛋白产生同向作用。 结论:CSE可引起AMs Dectin-1受体低表达和功能障碍，导致烟曲霉感染后吞噬能力降低和细胞因子异常表达。CSE引起的AMs抗曲霉防御能力下降部分是通过Dectin-1介导的。

目的:通过筛选香烟烟雾提取物（CSE）刺激下大鼠肺泡巨噬细胞存活率高、胞葬功能弱的时间点，建立肺泡巨噬细胞胞葬功能障碍体外模型，用于研究以慢性炎症反应为主要病理变化的慢性呼吸系统疾病。方法:①时间点筛选实验：体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383，取对数生长期细胞分为空白对照组（100 μL完全培养基）和5% CSE组（90 μL完全培养基+10 μL 100% CSE）；采用阿尔玛蓝法检测5% CSE作用6、12、24、48 h对NR8383细胞活性的影响。②诱导凋亡实验：体外培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞株RLE-6TN作为NR8383细胞的吞噬靶细胞，取对数生长期细胞分为空白对照组及紫外线暴露后10、30、60 min组（以30 000 μJ/cm 2紫外线强度照射15 min诱导凋亡）；采用流式细胞仪检测RLE-6TN细胞在紫外线暴露结束后10、30、60 min的凋亡率。③胞葬实验：另取对数生长期NR8383细胞分为空白对照组和5% CSE组。于CSE刺激NR8383细胞达到6、12、24 h前2 h，将RLE-6TN细胞进行紫外线暴露诱导凋亡；将RLE-6TN细胞悬液加入NR8383细胞（RLE-6TN细胞与NR8383细胞比例为5∶1）。采用流式细胞仪检测5% CSE作用不同时间点NR8383细胞对RLE-6TN细胞的胞葬率。 结果:①与空白对照组相比，5% CSE作用48 h后NR8383细胞活性明显降低〔细胞还原率：（68.5±4.1）%比（73.6±2.3）%， P<0.05〕；而5% CSE作用6、12、24 h对NR8383细胞活性的影响与空白对照组比较差异均无统计学意义，故选择这3个时间点用于后续建立肺泡巨噬细胞胞葬功能障碍体外模型实验。②与空白对照组相比，紫外线暴露后10、30、60 min时RLE-6TN细胞凋亡率均显著升高〔（66.87±8.63）%、（85.51±2.39）%、（96.13±2.74）%比（9.13±3.17）%，均 P<0.01〕，并且呈一定时间依赖性。考虑在胞葬实验中PKH26膜标记探针标记RLE-6TN细胞大约需50 min，因此，选择在紫外线暴露后10 min进行RLE-6TN细胞标记。③与空白对照组相比，5% CSE作用12 h时NR8383细胞的胞葬功能明显降低〔细胞胞葬率：（33.64±1.30）%比（44.02±2.71）%， P<0.01〕，而作用6 h、24 h时对NR8383细胞的胞葬功能无明显影响。 结论:CSE可诱导肺泡巨噬细胞胞葬功能障碍，基于5% CSE对NR8383细胞活性、胞葬功能影响的检测结果，可选择NR8383细胞存活率高、胞葬作用弱的12 h作为肺泡巨噬细胞胞葬功能障碍体外模型条件。

目的:探讨空气颗粒物(PM)及香烟烟雾提取物(CSE)对人肺泡上皮细胞(A549细胞)和单核细胞(THP-1细胞)源性巨噬细胞功能的影响。方法:采用不同浓度的PM与CSE单独或叠加体外刺激A549细胞和THP-1细胞，应用CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，酶联免疫吸附试验检测炎症因子表达，实时聚合酶链式反应检测巨噬细胞极化标志物，免疫蛋白质印迹法检测紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin的表达。结果:与空白对照组比较，0.5% CSE、50 mg/LPM单独刺激即可抑制A549细胞增殖；二者叠加刺激后，较CSE单独刺激组能够进一步抑制该细胞增殖活性，促进细胞凋亡；同时，在CSE存在时，PM可进一步促进A549细胞和THP-1细胞产生的炎症因子白细胞介素6及白细胞介素1β。PM单独或与CSE叠加均可降低A549细胞表达occludin。实时聚合酶链式反应结果显示，CSE与PM叠加进一步促进THP-1细胞表达CD80 mRNA。结论:PM能够进一步加重CSE暴露所导致的气道上皮抑制增殖、促进凋亡、炎症及巨噬细胞向M1型极化。

目的:探究间歇性缺氧(IH)是否通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路促进香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人支气管上皮细胞炎症因子分泌。方法:本研究为实验研究。采用CSE刺激BEAS-2B细胞24 h，并将细胞暴露于IH环境6、12、24 h后，ELISA检测细胞上清IL-6、IL-8的表达水平，CCK8检测细胞活性，western blot检测p-P65、P65、NLRP3、cleaved-caspase 1、cleaved-IL-1β的表达；向BEAS-2B细胞转染NLRP3 siRNA 24 h后，使细胞接受CSE和IH联合刺激24 h，western blot检测NLRP3、cleaved-caspase 1、cleaved-IL-1β的表达，ELISA检测IL-6、IL-8的分泌水平；CSE和IH联合刺激BEAS-2B细胞24 h，使用NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082预处理后，western blot检测p-P65、P65、NLRP3、cleaved-caspase 1的表达，ELISA检测IL-6、IL-8的分泌水平。结果:CSE+IH(24 h)组的IL-6[(287.13±31.74)ng/L比(179.53±21.71)ng/L]、IL-8[(786.77±66.46)ng/L比(450.80±24.89)ng/L]的分泌水平均高于CSE组( F值分别为36.30、57.95， P值均<0.001)，且细胞活性低于CSE组( F＝42.16， P<0.001)。CSE+IH组的NLRP3的mRNA表达以及p-P65/P65、NLRP3、cleaved-caspase 1、cleaved-IL-1β的蛋白表达均高于CSE组( F值分别为129.60、36.30、55.83、26.97、72.83， P值均<0.01)。CSE+IH+si-NLRP3组的NLRP3、cleaved-caspase 1、cleaved-IL-1β的蛋白表达均低于CSE+IH+si-NC组( F值分别为20.58、43.76、48.66， P值均<0.01)。CSE+IH+si-NLRP3组的IL-6、IL-8的分泌水平均低于CSE+IH+si-NC组( F值分别为38.23、24.73， P值均<0.01)。CSE+IH+BAY组的p-P65/P65、NLRP3、cleaved-caspase 1的蛋白表达均低于CSE+IH组( F值分别为42.17、54.70、40.18， P值均<0.001)。CSE+IH+BAY组的IL-6、IL-8的分泌水平均低于CSE+IH组( F值分别为48.63、60.38， P值均<0.001)。 结论:IH通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路促进CSE诱导的人支气管上皮细胞炎症因子分泌。

目的:探讨叉头蛋白M1反义长链非编码RNA(LncRNA FOXM1-AS)对香烟烟雾提取物(CSE)诱导的支气管上皮细胞(BEAS-2B)炎症因子表达和上皮-间质转化(EMT)的影响，并研究其潜在机制。方法:本研究为实验研究。培养BEAS-2B，采用随机数字表法分成对照组，CSE组(2.5% CSE处理)、siNC+CSE组(转染siNC，给予2.5% CSE处理)、siFOXM1-AS+CSE组(转染siFOXM1-AS，给予2.5% CSE处理)；通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应方法、酶联免疫吸附试验法和蛋白质印迹法检测各组FOXM1-AS、IL-6、TNF-α、E-cadherin、Vimentin基因表达水平和IL-6、TNF-α水平以及SOX6蛋白表达；利用生物信息学软件miRcode预测FOXM1-AS的潜在靶基因(miR-499a-5p)，荧光素酶报告基因实验鉴定二者的靶向关系。结果:与对照组比较，CSE组细胞中FOXM1-AS的表达水平显著增加(1.06±0.08比2.89±0.31， P<0.01)。利用siFOXM1-AS沉默FOXM1-AS后，明显抑制了CSE诱导的细胞炎症因子IL-6(2.63±0.34比1.39±0.23， P<0.01)、TNF-α(2.58±0.23比1.35±0.20， P<0.01)的表达，细胞EMT进程中，E-cadherin基因表达水平增加(0.35±0.10比0.92±0.08， P<0.01)，而Vimentin基因表达水平减少(2.37±0.28比1.41±0.20， P<0.01)。此外，FOXM1-AS通过靶向结合miR-499a-5p调控SOX6表达。miR-499a-5p抑制剂可逆转siFOXM1-AS对CSE诱导的细胞炎症因子表达及EMT的作用。 结论:下调FOXM1-AS靶向miR-499a-5p可抑制CSE诱导的BEAS-2B细胞炎症因子表达和EMT。

目的:基于Notch信号通路探讨补肺益肾方（BYF）抑制香烟烟雾提取物（CSE）诱导气道上皮细胞黏液高分泌的机制。方法:体外培养人气道上皮细胞株16HBE，取对数生长期细胞用于实验。①干预条件筛选实验：将16HBE细胞分组，分别采用噻唑蓝（MTT）比色法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测不同浓度CSE（2.5%、5%、10%、20%、40%）、不同浓度BYF含药血清（5%、10%、20%、40%）及不同浓度Notch信号通路阻断剂DAPT（5、10、20、40 μmol/L）对细胞活性与分泌黏蛋白5AC（MUC5AC）水平的影响，并设空白对照组，筛选出制备CSE诱导细胞黏液高分泌模型及BYF、DAPT干预的最佳条件。②干预实验：将16HBE细胞分为4组。空白对照组不给予任何处理；CSE模型组采用10% CSE诱导16HBE细胞24 h制备黏液高分泌模型；CSE+BYF组和CSE+DAPT组在加入10% CSE的同时分别给予10% BYF或20 μmol/L DAPT干预24 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测细胞中MUC5AC、Notch3和多毛分裂增强子1（HES1）的mRNA表达；采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测细胞中Notch3和HES1的蛋白表达。结果:①干预条件筛选实验结果：与空白对照组比较，10% CSE诱导24 h是既不影响细胞活性又可增加MUC5AC分泌的制备细胞黏液高分泌模型的最佳条件；而10% BYF和20 μmol/L DAPT为最佳干预条件。②干预实验结果：与空白对照组比较，CSE模型组细胞中MUC5AC、Notch3、HES1的mRNA表达及Notch3、HES1的蛋白表达均显著升高，说明CSE可能通过促进Notch3、HES1信号活化，诱导16HBE细胞分泌黏蛋白；与CSE模型组比较，BYF和DAPT均可显著下调细胞中MUC5AC、Notch3、HES1的mRNA及蛋白表达〔MUC5AC mRNA（2 -ΔΔCT）：1.03±0.13、0.96±0.05比1.35±0.07，Notch3 mRNA（2 -ΔΔCT）：1.10±0.14、1.10±0.02比1.31±0.15，HES1 mRNA（2 -ΔΔCT）：1.26±0.10、1.14±0.15比1.45±0.08，Notch3蛋白（Notch3/GAPDH）：0.10±0.03、0.16±0.03比0.31±0.09，HES1蛋白（HES1/GAPDH）：0.37±0.06、0.34±0.08比0.50±0.05，均 P<0.05〕。 结论:BYF可抑制CSE诱导的16HBE细胞黏液高分泌，其机制与抑制Notch信号通路活化有关。

目的:用香烟烟雾(CS)暴露联合聚肌胞苷酸(Poly I:C)滴鼻建立慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型,探讨COPD气道上皮屏障损伤的机制.方法:(1)将96只雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、CS组、Poly I:C组和CS+Poly I:C组,每组24只.第1～8周造模,每4周检测肺功能,于第4、8、16和24周末取材,每组取6只.测定每分钟通气量(MV)、气道狭窄指数(Penh)、肺泡平均截距(MLI)和支气管管壁厚度(BWT)的变化,检测白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和上皮钙黏素(E-Cad)水平.(2)用CS提取物(CSE)联合Poly I:C刺激人支气管上皮BEAS-2B细胞24 h,检测ZO-1、闭合蛋白(Occ)、磷酸化表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸化P38和磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)1/2蛋白水平.结果:(1)与对照组相比,第8周CS组和CS+Poly I:C组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润、肺泡腔扩张、肺泡壁断裂融合、气管壁增厚等病理变化,Penh、BWT、MLI、IL-1β和TNF-α显著升高(P<0.05或P<0.01),MV、ZO-1和E-Cad显著降低(P<0.05或P<0.01);第24周,CS+Poly I:C组以上病理变化仍较稳定存在.(2)与对照组相比,CSE联合Poly I:C显著诱导BEAS-2B细胞ZO-1和Occ蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01),EGFR、P38和ERK1/2磷酸化水平升高(P<0.01);且CSE联合Poly I:C组显著优于CSE组和Poly I:C组.结论:Poly I:C可以促进CS诱导的COPD模型小鼠病理改变和气道上皮屏障损伤,其机制可能与激活EGFR/ERK/P38信号通路有关.

目的 探讨microRNA-195/497(miR-195/497)在香烟烟雾提取物(CSE)诱导的人支气管上皮细胞中影响转化生长因子-β(TGF-β)表达的作用机制.方法 用3％CSE诱导BEAS-2B细胞模拟慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病机制,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-195、miR-497、SMAD7及TGF-β基因表达.双荧光素酶报告实验验证miR-195、miR-497与SMAD7的靶向关系,将miR-195 mimic 和 miR-497 mimic 转染至 3％CSE 处理的细胞中,qRT-PCR 检测 SMAD7 的表达.将 miR-195 mimic、miR-497 mimic 和 si-SMAD7 转染至 3％CSE 处理的细胞中,qRT-PCR 检测 miR-195、miR-497、SMAD7、TGF-β 的基因表达,Western blotting 检测 SMAD7、TGF-β 的蛋白表达.结果 3％CSE 组 miR-195、miR-497 mRNA相对表达量低于正常细胞组(P＜0.05),SMAD7、TGF-β mRNA相对表达量高于正常细胞组(P＜0.05).miR-195 mimic 组 Wt-SMAD7 mRNA相对表达量低于 mimic NC 组(P＜0.05).miR-195 mimic 组与mimic NC组 Wt-SMAD7 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).miR-497 mimic组 Wt-SMAD7 mRNA 相 对表达量低于 mimic NC 组(P＜0.05).miR-497 mimic 组与 mimic NC 组 Mut-SMAD7 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(P＞0.05).miR-195 mimic组SMAD7 mRNA相对表达量低于mimic NC 组(P＜0.05).miR-497 mimic 组 SMAD7 mRNA 相对表达量低于 mimic NC 组(P＜0.05).3％CSE组细胞miR-195和miR-497相对表达量较Control组下降(P＜0.05),SMAD7及TGF-β蛋白相对表达量升高(P＜0.05);miR-195 mimic+3％CSE 组细胞miR-195 相对表达量较3％CSE 组升高(P＜0.05),SMAD7、TGF-β下降(P＜0.05),而miR-497相对表达量无明显差异(P＞0.05);miR-497 mimic+3％CSE组细胞miR-497相对表达量较3％CSE组升高(P＜0.05),SMAD7、TGF-β下降(P＜0.05),而miR-195相对表达量无明显差异(P＞0.05);si-SMAD7+3％CSE组SMAD7、TGF-β蛋白相对表达量较3％CSE组下降(P＜0.05),而 miR-195、miR-497无明显差异(P＞0.05).3％CSE组SMAD7、TGF-β蛋白相对表达量较Control组升高(P＜0.05),miR-195 mimic+3％CSE 组、miR-497 mimic+3％CSE 组、si-SMAD7+3％CSE 组较3％CSE 组下降(P＜0.05).结论 miR-195/497可通过调控SMAD7的表达影响CSE诱导的人支气管上皮细胞中TGF-β表达.

目的:观察香烟烟雾提取物(CSE)干预不同时间下肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能的变化,探讨其对肺部疾病炎症反应的影响及分子机制.方法:大鼠肺泡巨噬细胞NR8383采用10%CSE分别干预6 h、12 h、24 h、48 h,分为6 h空白对照组、6 h-10%CSE组、12 h空白对照组、12 h-10%CSE组、24 h空白对照组、24 h-10%CSE组、48 h空白对照组、48 h-10%CSE组.10%CSE干预12 h后联用PPAR抑制剂/激动剂,分为PPAR抑制剂组、PPAR激动剂组.Alamar Blue法检测PPAR激动剂对NR8383细胞增殖及毒性作用;流式细胞术检测NR8383细胞胞葬、吞噬功能及M1、M2极化分型;酶联免疫吸附实验检测TNF-α、TGF-β1、MFG-E8含量;免疫印迹法检测PPARγ信号通路及下游分子CD36蛋白表达;qPCR检测PPARγ、CD36 mRNA的表达.结果:10%CSE干预6 h后,NR8383细胞吞噬及胞葬功能均有所升高,PPARγ表达下调,CD36 mRNA表达增加,TNF-α、TGF-β1、MFG-E8表达均升高,但无明显极化方向;干预12 h,NR8383细胞吞噬功能及胞葬率显著降低,PPARγ、CD36表达显著下调,TNF-α表达增强,TGF-β1、MFG-E8表达降低,向M1型巨噬细胞极化;干预24 h后,NR8383细胞胞葬率降低,但吞噬大肠杆菌的功能增强,PPARγ表达下调,CD36蛋白表达降低,TNF-α表达降低但差异无统计学意义,TGF-β1、MFG-E8表达仍处于降低状态,有明显的M1型极化倾向;48 h后NR8383细胞胞葬率仍旧降低,但吞噬能力显著提升,PPARγ表达显著降低,CD36表达显著增加,TNF-α表达降低,TGF-β1、MFG-E8表达增加,巨噬细胞向M1、M2方向极化均增加.选择10%CSE干预12 h联合PPAR激动剂、抑制剂后发现,PPAR激动剂增强NR8383细胞胞葬及吞噬能力,上调PPARγ、CD36表达,抑制炎症因子TNF-α表达,促进抑炎因子TGF-β1、胞葬辅助因子MFG-E8表达.结论:随着CSE干预时间的变化,肺泡巨噬细胞从早期炎症反应的活化状态,逐渐进展为慢性炎症反应状态,进而导致肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能障碍,该机制与PPARγ通路被抑制有关.

目的 探讨香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对破骨细胞体积及整合素αvβ3 基因表达的影响.方法 首先制作CSE溶液,实验采用 7周龄C57BL/6J小鼠骨髓单个核细胞加入M-CSF和RANKL诱导生成破骨细胞,将浓度为 5%的CSE加入实验组破骨细胞作用 3 d,对照组不加入CSE.通过Trap染色识别对照组和实验组破骨细胞并于光镜下采图;通过甲苯胺蓝染色识别两组破骨细胞在骨片上形成的骨陷窝并于光镜下采图,均用NIH imageJ计算数量及面积.用实时荧光定量聚合酶链反应,以GAPDH作为内参,最后通过2-ΔΔCT计算,以检测Trap、CTR以及整合素αvβ3 mRNA表达水平.通过Western blot检测整合素αvβ3蛋白表达.结果 破骨细胞表面积及细胞核数量的计量表明,实验组诱导形成的破骨细胞显著大于对照组(P<0.01).实验组骨片上吸收陷窝数量及面积明显多于对照组(P<0.05),CSE处理组的TRAP mRNA水平为 1.16±0.13,明显高于对照组(P<0.05),CTRmRNA水平为 0.38±0.04,明显低于对照组(P<0.01).CSE处理组的整合素αvβ3 mRNA水平为 1.75±0.05,显著高于对照组(P<0.01),蛋白质印迹分析结果也明显高于对照组(P<0.05).结论 CSE能显著增加破骨细胞的体积并上调整合素αvβ3的基因表达,并可能对骨吸收有促进作用.