[目的]海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成过程中的关键酶之一.本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖合成酶基因,分析其对不同温度胁迫的响应,以期进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的分子调控机制.[方法]通过RACE技术克隆沙葱萤叶甲TPS基因的全长cDNA序列,并对该基因进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测TPS基因在不同温度下沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化.[结果]克隆获得沙葱萤叶甲TPS基因,将其命名为GdTPS(GenBank登录号:KY460114),该基因全长2 706 bp,开放阅读框(ORF)长2 496 bp,编码831个氨基酸;蛋白预测分子量为94.05 kD,等电点为6.82,无信号肽和跨膜结构,包含3个N-糖基化位点.GdTPS有两个保守功能区,与其他昆虫TPS具有较高的同源性,其中与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPS亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为88％.实时荧光定量PCR结果表明,温度低于25℃(对照)时,GdTPS表达量随着温度下降而上升,-10℃时达到最高值;高于25℃时,GdTPS表达量随着温度上升而上升,40℃时达到最高值.[结论]沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPS的表达来应对高温和低温胁迫,该结果为揭示TPS在昆虫应对温度胁迫过程中作用的分子机制提供了基础.

SSR作为一种微卫星分子标记方法,被广泛用于遗传多样性相关的研究,而SSR引物是否高效是影响整个实验结果的重要因素.本研究利用生物信息学手段,对马铃薯甲虫基因组数据进行分析,搜索基因组SSR位点,并设计引物和验证SSR引物的效率.最终在马铃薯甲虫基因组中共检测出SSR位点81 937个,且这些位点中以单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重复为主;从SSR位点的平均分布距离来看,单、三、四核苷酸重复在马铃薯甲虫基因组中平均分布距离较小,分别为2.21 kb、8.39 kb、36.21 kb.马铃薯甲虫基因组SSR位点中,优势基序总数为68 388个,比例高达83.46％,其中,单核苷酸以A/T重复基序占绝对优势,二核苷酸重复的SSR位点中,以AG/CT重复基序为主,三核苷酸重复的位点中,以AAT/ATF重复基序为主;在Class Ⅰ长度的SSR位点中,以二核苷酸、三核苷酸重复的数量最多,比例高达82.32％;最后设计19对SSR引物测试效率,其中14对成功扩增条带,11对为多态性引物,其平均多态性条带6.27条.多态性引物的PIC值在0.375-0.794,平均值为0.600,大于平均值的引物为6对,占有效扩增引物的54.5％.研究表明,利用生物信息发掘SSR位点的方法简便高效,这为后续进一步利用SSR引物研究马铃薯甲虫的遗传多样性,及在其它昆虫中开发SSR引物开发奠定研究基础.

[目的]海藻糖酶(trehalase,Tre) 作为昆虫体内海藻糖代谢的关键性酶,在昆虫能量调节和生长发育中具有重要作用.本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica 海藻糖酶基因,并对其表达模式进行定量分析,以期探究海藻糖酶在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中的作用.[方法]根据沙葱萤叶甲转录组数据,采用RACE 技术,克隆得到Tre 基因的cDNA 全长,并进行生物信息学分析; 应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 技术检测其在沙葱萤叶甲不同发育阶段[卵、 1 - 3龄幼虫、预蛹、蛹、成虫(羽化后3,7,10,15,25,40,60,80 和100 d) ]、成虫不同组织(头、胸和腹) 以及3 日龄成虫在不同温度(15,20,25,30,35 和40℃) 胁迫下的表达水平; 采用3,5-二硝基水杨酸法测定不同日龄成虫体内海藻糖酶活性.[结果]克隆获得了沙葱萤叶甲可溶性海藻糖酶基因,并命名为GdTre1(GenBank 登录号: KY697913),该基因全长1 933 bp,开放阅读框1 704 bp,编码567 个氨基酸; 蛋白预测分子量为66. 56 kD,等电点为6. 62; 编码蛋白具有海藻糖酶超基因家族典型的功能结构域,包含1 条信号肽,不具有跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdTre1 与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Tre1b 的同源性最高,氨基酸序列一致性达 70. 25％.RT-qPCR 检测结果表明,GdTre1 在沙葱萤叶甲各发育阶段均有表达,其中在卵期和成虫滞育期间高表达,而在幼虫、预蛹、蛹及成虫滞育前低表达; 在成虫不同组织中,通常在腹部中表达量最高,其次为胸部,最低为头部; GdTre1 表达量随着温度升高而上升,30℃达最高值,而后随温度升高略有下降.沙葱萤叶甲不同日龄成虫体内GdTre1 表达量及Tre 活性存在显著差异,且GdTre1表达量与Tre 活性变化趋势一致.[结论]海藻糖酶与沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育有密切的关系.该结果为进一步揭示该虫的夏滞育分子机理提供了必要的基础.

[目的]通过RNAi技术分析明确对马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata黑色素形成重要的N-β-丙酰多巴胺(NBAD)水解酶基因的功能.[方法]NBAD水解酶基因通过马铃薯甲虫转录组数据分析和RT-PCR克隆获得,分别利用序列比对和系统发育分析确定该基因的完整性和系统发育;通过qPCR检测其在马铃薯甲虫各发育阶段和4龄幼虫不同组织及成虫精巢和卵巢中的表达量;采用喂食幼虫dsRNA的方法,观察该基因在马铃薯甲虫幼虫的生长发育过程中对体色的影响,并测定保幼激素和蜕皮激素对该基因表达的影响.[结果]克隆得到马铃薯甲虫NBAD水解酶基因,命名为Ldtan(GenBank登录号:KY221866),其编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目赤拟谷盗Tribolium castaneum和山松大小蠹Dendroctonus ponderosae同源蛋白的氨基酸序列的一致性最高,聚为一支.Ldtan在马铃薯甲虫4龄幼虫腹神经索(99.36±0.95)、后肠(17.79±3.11)和表皮(9.21±0.12)中的相对表达量较高;在幼虫期随幼虫生长发育表达量逐渐升高,在成虫期的表达量最高.通过喂食2龄幼虫Ldtan的dsRNA能有效降低靶标基因的表达量,使幼虫体色变深呈一定的棕褐色,并且具有一定的致死效应.通过RNAi技术干涉保幼激素合成和信号途径相关基因,发现Ldtan表达量降低,而干扰蜕皮激素合成和信号途径相关基因,Ldtan表达量增加.[结论]结果提示Ldtan参与了马铃薯甲虫的黑色素合成,并且蜕皮激素和保幼激素可能影响其表达.

[目的]昆虫气味结合蛋白(OBPs)在昆虫嗅觉行为中发挥着重要作用.马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是马铃薯上一种最主要的毁灭性害虫.为阐明该虫嗅觉识别分子机制,本研究对马铃薯甲虫26个OBP基因序列特征及组织表达谱进行研究.[方法]基于马铃薯甲虫触角转录组测序数据,利用生物信息学方法及qRT-PCR技术,分别对马铃薯甲虫26个LdecOBPs(LdecOBPl-LdecOBP26)的系统进化及基因的组织表达谱进行分析.[结果]除LdecOBP26基因外,其余25个LdecOBPs基因序列均具有完整的开放阅读框,编码120～255个氨基酸残基,预测的蛋白分子量为13.66～29.38 kD,等电点为4.12～8.42,它们属于两个亚家族,其中13个为Classical-C OBPs,12个为Minus-C OBPs.除LdecOBP3和LdecOBP26外,其他24个LdecOBPs的N端均由16～23个氨基酸组成的信号肽序列.不同的OBPs亚家族均具有各自典型保守的Cys残基.LdecOBPs之间高度分化,氨基酸序列一致性在3.20％～41.91％.系统进化树分析表明,LdecOBPs与沙葱萤叶甲Galeruca daurica的GdauOBPs亲缘关系最近.基因表达谱分析显示,26个LdecOBPs基因在马铃薯甲虫的不同组织中表达,其中有12个LdecOBPs基因(LdecOBP2,LdecOBP4,LdecOBP6,LdecOBP9,LdeOBP10,LdecOBP12,LdecOBP13,LdecOBP16,LdecOBP20-22和LdecOBP24)在触角中高表达,2个LdecOBPs基因(LdecOBP5和Ldec OBP 17)在足中高表达,其他12个LdecOBPs基因(LdecOBP1,LdecOBP3,LdecOBP7,LdecOBP8,LdecOBP11,LdecOBP14,LdecOBP15,LdecOBP18,LdecOBP19,LdecOBP23,LdecOBP25和LdecOBP26)在触角、头(去除触角)、胸、腹、足和翅这些组织中均表达.[结论]本研究结果为进一步研究马铃薯甲虫嗅觉识别分子机制奠定了基础.

[目的]通过RNAi技术明确马铃薯甲虫TOR上游的关键信号集成节点及类胰岛素信号通道下游基因结节性硬化复合物TSC1和TSC2的功能.旨在为探明马铃薯甲虫类胰岛素信号转导提供更多理论支持.[方法]在NCBI(美国国家生物技术信息中心)获取马铃薯甲虫LdTSC1/2序列,分别利用多重序列比对和系统发育分析确定该基因的完整性和系统发育关系;采用喂食幼虫dsRNA的方法,观察该基因的调低对马铃薯甲虫幼虫生长发育、糖脂代谢的影响.[结果]克隆得到马铃薯甲虫TSC1编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁直系同源蛋白的氨基酸序列的自展一致度为100％,聚为一支;TSC2编码蛋白的氨基酸序列与鞘翅目白蜡窄吉丁和赤拟谷盗的同源蛋白氨基酸序列的自展一致度为100％,聚为一支.通过分别喂食2龄幼虫LdTSC1/2的dsRNA能有效降低靶标基因的表达量,幼虫出现体重减轻,化蛹率和羽化率显著下降,葡萄糖的吸收转化效率降低,海藻糖含量升高和甘油三酯均减少.[结论]下调2龄幼虫LdTSC1/2的表达量,导致试虫出现抑制了糖脂代谢、脂肪体减少、体重减轻以及发育延迟;结果表明LdTSC1/2调控了马铃薯甲虫幼虫的糖脂代谢过程,显著影响幼虫化蛹和蜕皮过程.

[目的]克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica保幼激素结合蛋白基因(Juvenile hormone binding protein,JHBP) cDNA全长序列,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用奠定基础.[方法]基于本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组数据库,采用RACE技术,克隆沙葱萤叶甲GdJHBP基因cDNA全长序列;运用ORF Finder、SignaIP、DNAMAN和TMHMM等软件分析其分子特征;利用MEGA6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;应用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育时期、成虫不同组织及高温胁迫下的表达模式.[结果]克隆获得了沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP cDNA全长序列(GenBank登录号:MG460309),cDNA全长为826 bp,开放阅读框(ORE)为714 bp,编码237个氨基酸;蛋白质预测分子量为26.58 ku,等电点为4.37;包含1条信号肽,无跨膜区,且在第27-189位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域.序列比对分析表明,不同昆虫JHBP间氨基酸序列一致性较低,沙葱萤叶甲GdJHBP与棕榈象Rhynchophorus ferrugineus RfJHBP和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata JHBP 3p2的氨基酸序列一致性最高也仅为30％.系统发育分析表明,GdJHBP与棕榈象血淋巴JHBP亲缘关系最近.RT-qPCR结果显示,GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高,在卵和蛹期微量表达;在成虫滞育期间低表达,在滞育前与滞育结束后则有较高表达;在成虫发育过程中,头部的表达量显著低于腹部和胸部;高温(30-40℃)可诱导GdJHBP上调表达,在35℃时表达量达到最高值.[结论]沙葱萤叶甲GdJHBP属于血淋巴JHBP,在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中可能发挥着重要作用.

[目的]表皮蛋白是昆虫体壁的主要组成部分,在昆虫生长发育中起着重要的作用.本研究旨在鉴定沙葱萤叶甲Galeruca daurica表皮蛋白基因,分析其表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育中的作用提供必要的基础.[方法]根据本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用生物信息学方法鉴定表皮蛋白基因全长开放阅读框(ORF);采用RT-qPCR技术测定鉴定的8个表皮蛋白基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和3龄幼虫不同组织(头部、体壁、消化道和脂肪体)中的表达谱.[结果]基于转录组数据鉴定到8条沙葱萤叶甲表皮蛋白基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为GdauCP1-8(GenBank登录号:MN629000-MN629007),ORF长417～810 bp,编码138 ～269个氨基酸,预测分子量为15 ～ 28 kD,等电点pI为4.45～8.62;具有16 ～20个氨基酸的信号肽;GdauCP1具有典型的跨膜结构,其余7个GdauCP蛋白无跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdauCP3与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata CP的氨基酸序列一致性最高,为60.00％;其余的GdauCPs与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera CP的氨基酸序列一致性最高,为58.52％～80.00％.GdauCP1-4属于RR-2亚家族,GdauCP5-7属于RR-1亚家族,GdauCP8的亚家族归属未确定.RT-qPCR分析表明,8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段及3龄幼虫不同组织内均有表达,且表达量存在显著差异.G dauCP2,GdauCP4,GdauCP5和GdauCP6在1龄幼虫期高表达,GdauCP3,GdauCP7和GdauCP8在蛹期高表达,GdauCP1在3龄第3天幼虫期高表达;除GdauCP2在成虫中表达水平较高外,其他GdauCP基因在成虫中的表达水平均很低.GdauCP1在头部和体壁中高表达,GdauCP2和GdauCP8在脂肪体中高表达,GdauCP3,GdauCP4,GdauCP6和GdauCP7在消化道中高表达,而GdauCP5在体壁中高表达.[结论]8个GdauCP基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段和组织间差异表达,且表达模式不同,意味着不同GdauCP可能具有不同的功能.

马铃薯甲虫是一种外来的有害生物,已在新疆、黑龙江等地建立种群,危害马铃薯、番茄等农作物,危害范围在中国逐年蔓延扩大.预测马铃薯甲虫在中国的适生区,有利于制定该虫的早期监测预警及控制.根据马铃薯甲虫现有的分布记录,筛选出主要的环境变量,采用MaxEnt模型和ArcGIS软件对其在中国的潜在分布区进行预测和分析.结果 表明:用主成分分析法、相关性检验结合刀切法筛选出7个主要环境变量,MaxEnt模型模拟的AUC值为0.917,预测结果与实际拟合度非常高;ArcGIS软件中重分类方法计算出马铃薯甲虫当代适生区总面积为3.72×106 km2,占中国国土面积的38.67％;高适生区仅占中国国土面积的0.08％,主要位于内蒙古自治区包头市和呼和浩特市辖区;中适生区面积为1.26×106 km2,占中国国土面积的13.07％,包括黑龙江、辽宁和河北的东部,四川的西部,甘肃的西南部,河南的西北部,山西的南部,新疆的北部,江苏、湖北、贵州和安徽的中部地区,山东广大地区以及内蒙古包头市周边;低适生区面积为2.45×106 km2,占中国国土面积的25.52％,主要分布在内蒙古中部、新疆北部、东北东部、华北、华中和华南的广大地区;年平均温度、最冷月最低温度和最干季度降水量是影响马铃薯甲虫适生区分布的最主要环境变量.

农田作物布局作为害虫生态调控的重要内容,一直是保护性生物防治的研究热点.为进一步明确马铃薯田块作物间套作种植模式对马铃薯甲虫种群动态的影响,探索马铃薯甲虫可持续防控的新思路与新方法,本研究在马铃薯甲虫发生期对马铃薯-玉米、马铃薯-向日葵、马铃薯单作3种作物间套作模式进行田间种群数量调查,分析比较不同种植模式下的马铃薯甲虫种群动态差异.结果表明:在马铃薯甲虫发生期,马铃薯单作第二代幼虫为害高峰期出现晚于两种间套作模式,第一代成虫为害高峰期早于两种间套作模式.第二代幼虫为害低峰期(8月26日-9月7日)时,马铃薯-玉米间套作幼虫量显著低于马铃薯单作(P<0.05),马铃薯-玉米间套作幼虫量显著低于马铃薯-向日葵(P<0.05),整个调查期间,马铃薯单作虫量要大于两种间套作.此外,天敌昆虫群落调查表明:间套作玉米异色瓢虫量显著高于马铃薯单作(P<0.05),间套作向日葵的草蛉、食蚜蝇虫量高于马铃薯单作.间套作向日葵或玉米对越冬代马铃薯甲虫的扩散有影响,马铃薯播种初期间套作向日葵或玉米能在一定程度上阻隔马铃薯甲虫的定殖扩散.