[目的]本研究旨在建立皂角豆象Megabruchidius dorsalis雌雄成虫触角转录组数据库,挖掘皂角豆象嗅觉相关基因.[方法]采用高通量测序平台Illumina HiSeq对皂角豆象雌雄成虫触角进行转录组测序、序列组装、功能注释及差异表达基因分析;通过qRT-PCR技术测定和验证皂角豆象雌雄成虫触角中部分高丰度表达基因的表达量.[结果]皂角豆象雌雄成虫触角转录组共获得42 053条 unigenes,N50 长度为 2 066 bp.与 NR,Swiss-Prot,Pfam,eggNOG,GO 和 KEGG 六大公共数据库比对共注释到18 039条unigenes(占43.57％),其中注释到NR数据库的unigenes数量最多,为17 687条;注释到KEGG数据库的unigenes数量最少,为9 779条.依据注释信息分析,鉴定出183个皂角豆象候选嗅觉相关基因,包括25个气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因、3 个化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、126 个气味受体(odorant receptor,OR)基因(包括125个典型OR基因和1个非典型OR基因)、8个离子型受体(ionotropic receptor,IR)基因、18个味觉受体(gustatory receptor,GR)基因和3个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因.通过比较皂角豆象雌雄成虫触角转录组,共筛选出357个差异表达基因,其中包含8个OR基因和1个IR基因;这357个差异表达基因中,152个基因在雌性触角中高表达,205个基因在雄性触角中高表达.此外,qRT-PCR验证结果显示,6个嗅觉相关基因(MdorCSP3,MdorIR2,MdorIR6,MdorGR10,MdorSNMP2和MdorSNMP3)在皂角豆象雌成虫触角中高表达,4个嗅觉相关基因(MdorOBP1 5,MdorOBP22,MdorORco和MdorGR8)在雄成虫触角中高表达.[结论]本研究获得了皂角豆象成虫触角转录组数据,并鉴定筛选出候选嗅觉相关基因,结果为进一步研究皂角豆象的基因功能及嗅觉感受机制奠定分子基础.

[目的](反,反)-8,10-十二碳二烯-1-醇[(8E,10E)-dodecadien-1-ol,E8,E10-12∶OH]是苹果蠹蛾Cydia pomonella的主要性信息素成分,对梨小食心虫Grapholita molesta性诱剂具有引诱增效作用.本研究旨在测定E8,E10-12∶OH对梨小食心虫性诱剂的增效能力,确定主要结合E8,E10-12∶OH的信息素结合蛋白(pheromone binding proteins,PBPs)和普通气味结合蛋白(general odorant binding proteins,GOBPs).[方法]利用触角电位(electroantennogram,EAG)仪测定梨小食心虫雄成虫对 0.002,0.02,0.2,2,20,200 和 2 000 μg E8,E10-12∶OH 激发的 EAG 反应;利用田间诱集试验测定E8,E10-12∶OH对梨小食心虫性诱剂的增效能力;利用荧光竞争结合实验测定梨小食心虫信息素结合蛋白GmolPBP1,GmolPBP2和GmolPBP3及普通气味结合蛋白GmolGOBP1,GmolGOBP2和GmolGOBP3与E8,E10-12∶OH的抑制常数Ki;利用分子动力学模拟的方法预测GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸;利用定点突变和荧光竞争结合实验验证GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸残基及弱相互作用力.[结果]梨小食心虫雄成虫对E8,E10-12∶OH表现出EAG反应,雄成虫对2 000 μg E8,E10-12∶OH的EAG反应值最高[(0.57±0.14)mV].在梨小食心虫性诱剂中添加200 μg E8,E10-12∶OH时,增效效果最佳,增效倍数达 2.46 倍.GmolGOBP2 结合 E8,E10-12:OH 的能力最强[Ki=(1.92±0.05)μmol/L],是结合E8,E10-12∶OH的主要OBP.分子动力学模拟表明GmolGOBP2的Phe18,Ile100,Glu104,Val117和Phe124结合 E8,E10-12∶OH 的自由能最低,分别为-1.18,-1.33,-3.34,-1.19 和-1.58 kj/kg,预测是GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的重要位点,将以上5个残基定点突变为丙氨酸Ala后,突变体蛋白E104A和F124A失去了结合E8,E10-12∶OH的能力,表明Glu104和Phe124是GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸.[结论]E8,E10-12∶OH是开发梨小食心虫高效性诱剂的理想增效剂,GmolGOBP2在梨小食心虫识别种间性信息素E8,E10-12∶OH的过程中发挥着重要作用,Glu104和Phe124是GmolGOBP2结合E8,E10-12∶OH的关键氨基酸残基.

[目的]本研究旨在通过建立团花绢野螟Diaphania glauculalis成虫触角转录组数据库,挖掘化学感受相关基因,为团花绢野螟成虫触角的化学感受机制及绿色防控技术提供理论基础.[方法]使用Illumina NovaSeq 6000平台对团花绢野螟成虫触角转录组进行测序,使用Trimmomatic和Trinity对测序所得的原始数据进行剪切、组装得到转录组数据;比对CDD,KOG,COG,NR,NT,PFAM和KEGG等数据库获得基因注释信息,筛选鉴定出化学感受相关基因;使用TPM(transcripts per million)评估化学感受相关基因的表达量;应用最大似然法构建团花绢野螟化学感受相关基因系统发育树.[结果]团花绢野螟雄成虫触角转录组测序获得52 705 124条unigenes,雌成虫触角转录组测序获得55 391 610条unigenes.通过与NR数据库比对注释,团花绢野螟成虫触角转录组注释unigenes共24 192条,其中与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis的同源序列最多,有10 679条.有14 313条unigenes被注释到204 289条GO功能条目,其中113 387条unigenes注释到生物学进程,70 115条unigenes注释到细胞组分,20 787条unigenes注释到分子功能.有10 721条unigenes注释到KOG数据库25个分类的11 968功能条目.有12 892条unigenes被注释到KEGG数据库5类代谢通路,归属于33个通路,其中注释到信号转导通路的unigenes最多,有1 500条unigenes,进而筛选鉴定到136个化学感受相关基因,包括31个气味结合蛋白(odorant-binding protein,OBP)基因、24 个化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因、50 个气味受体(odorant receptor,OR)基因、20个离子型受体(ionotropic receptor,IR)基因、9个味觉受体(gustatory receptor,GR)基因和2个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein,SNMP)基因.[结论]本研究首次构建了团花绢野螟成虫触角转录组数据库,阐述了化学感受相关基因的种类和数量,为团花绢野螟化学感受基因功能分析及化学感受机制奠定分子基础,进而为基于昆虫化学感受反应机制开发新的绿色防控技术提供理论支撑.

[目的]本研究旨在为深入研究梨小食心虫Grapholita molesta尼曼-匹克C2型蛋白(Niemann-Pick type C2 protein,NPC2)GmolNPC2的嗅觉感受功能提供理论参考.[方法]基于梨小食心虫触角转录组数据,利用RT-PCR扩增GmolNPC2的cDNA全长序列,进行系统进化分析和3D结构模型预测;利用RT-qPCR检测GmolNPC2在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和雌雄成虫)、3日龄雌雄成虫不同组织(触角、去除触角的头、胸、腹、足和翅)中的相对表达量;利用荧光竞争结合实验测定重组GmolNPC2蛋白对包括6种性信息素和38种寄主植物挥发化合物在内的44种气味配体的抑制常数Ki 值,分析结合能力;通过分子对接模拟实验计算GmolNPC2与不同气味配体的结合能,预测蛋白和配体相互作用的关键氨基酸残基.[结果]获得梨小食心虫GmolNPC2(GenBanK登录号:OQ054801)的cDNA全长序列,开放阅读框(ORF)长438 bp,编码145个氨基酸;多序列比对发现GmolNPC2具有昆虫NPC2典型的结构特征;系统进化分析表明已知鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的 NPC2s 聚类至 2 个分枝,GmolNPC2 与大豆食心虫 Leguminivora glycinivorella、红铃虫Pectinophora gossypiella和烟草天蛾Manduca sexta等的NPC2氨基酸序列一致性较高并聚类至同一分枝.RT-qPCR检测结果表明,GmolNPC2在梨小食心虫雄成虫和卵中的表达量显著高于其他发育阶段的;GmolNPC2在3日龄雌雄成虫翅中的表达量最高,在触角中的次之,在胸、腹和足中的最低.重组蛋白GmolNPC2的结合谱较窄,仅能够结合44种气味配体中的17种,对其中的乙酸-顺-8-十二碳烯酯、苯甲醇和乙酸-顺-3-己烯酯表现出强烈的结合能力,Ki 值分别为(4.117± 0.046),(4.845±0.079)和(3.979±0.167)μmol/L.分子对接模拟结果显示,GmolNPC2 与不同气味配体之间的结合能存在差异,与上述荧光结合实验的结果较一致.疏水性氨基酸残基和氢键在GmolNPC2结合不同气味配体中发挥着重要作用.[结论]GmolNPC2具有昆虫NPC2家族的保守结构,在卵和成虫以及成虫翅和触角中的表达量较高,推测其参与梨小食心虫的多种生理过程.重组蛋白GmolNPC2能够选择性地结合性信息素和寄主植物挥发化合物,表明GmolNPC2参与对挥发性信息物质的识别和运输.

[目的]通过分析绿豆象Callosobruchus chinensis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)CchiOBP3与绿豆Vigna radiata挥发物配体的结合特性,研究CchiOBP3在绿豆象嗅觉识别中的功能,为阐明绿豆象定位寄主的嗅觉识别机理提供理论依据.[方法]采用SWISS-MODLE软件对绿豆象CchiOBP3进行同源建模,采用SAVES 6.0软件对模型进行评估,并采用Autodock 4.2.6软件对CchiOBP3与26种绿豆挥发物配体进行分子对接模拟;通过原核表达和亲和柱层析获得CchiOBP3重组蛋白,运用荧光竞争结合实验验证CchiOBP3重组蛋白与4种高结合能绿豆挥发物配体的结合特性,并通过触角电位(electroantennogram,EAG)实验检测绿豆象雌成虫对4种挥发物配体的反应.[结果]CchiOBP3与26种配体中的17种配体形成了氢键,氢键位置主要在第112位的苯丙氨酸(phenylalanine);筛选出与CchiOBP3结合能较高的4种配体反式石竹烯、4-萜烯醇、环已基苯和2-甲基萘,CchiOBP3与其中的4-萜烯醇(Ki=7.16 μmol/L)、环己基苯(Ki=7.45 μmol/L)和2-甲基萘(Ki=13.97 μmol/L)具有较强的结合能力.此外,4种挥发物配体均能引起绿豆象雌成虫的EAG反应,且4-萜烯醇引起的反应最强.[结论]CchiOBP3可与3种绿豆挥发物配体结合,推测CchiOBP3在绿豆象定位寄主的过程中发挥着重要作用.

[目的]锈色棕榈象Rhynchophorus ferrugineus为危害棕榈科植物的重要入侵害虫,为获得该害虫气味结合蛋白(Odorant binding protein,OBP)的三维结构,从而基于计算反向化学生态学方法筛选潜在对该害虫行为具有调控作用的挥发物用于防控奠定基础.[方法]以蛋白质数据库中已经报道的昆虫OBP晶体结构为模板,采用同源建模方法构建获得了该害虫2个OBP的三维结构.模建结构通过Procheck、Verify_3D和ERRAT进行评价,得到的评估分值均表明模建结构质量高.[结果]三维模建结构显示,这2个锈色棕榈象OBP由6个 α-螺旋和连接这些螺旋的回折构成,6个半胱氨酸形成的3对二硫键起到了稳定结构的作用.[结论]模建结构的获得,为今后通过分子对接筛选潜在的活性挥发物用于防控锈色棕榈象奠定了基础.

[目的]气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)有助于提高昆虫嗅觉系统的敏感性,并且在蚜虫报警信息素反-β-法尼烯[(E)-β-famesene EBF]的通信过程中起重要作用.萝卜蚜Lipaphis erysimi是十字花科作物的主要害虫,为了减少蔬菜田间的农药使用,EBF对蚜虫防治具有很大的潜力.然而,目前萝卜蚜对EBF反应的研究甚少.[方法]本研究利用PCR和RACE技术克隆并鉴定了2种公认的在萝卜蚜中对EBF具有高度亲和力的气味结合蛋白的基因LeryOBP3和LeryOBP7;利用RT-qPCR检测了它们在萝卜蚜不同发育阶段和无翅成蚜不同组织中的表达谱.[结果]克隆获得的萝卜蚜2个基因序列LeryOBP3(GenBank登录号:KJ703012)和LeryOBP7(GenBank登录号:KJ703013)分别与豌豆蚜Acyrthosiphum pisum ApisOBP3和ApisOBP7序列对比有较高的氨基酸序列一致性(分别为94％和88％),基因序列符合气味结合蛋白基因的典型特征.LeryOBP3和LeryOBP7开放阅读框全长分别为357和468 bp,分别编码118和155个氨基酸.发育表达谱表明,LeryOBP3和LeryOBP7的表达量高峰出现于成虫期;组织表达谱表明,LeryOBP3在成蚜足中表达量较高,而LeryOBP7主要表达于成蚜触角组织中.[结论]在萝卜呀成虫触角中的LeryOBP7结合蛋白可能与其对EBF的响应有关.

胶类药材是中国传统医药中特有的一类药材.由于市场需求量大、原材料紧缺及缺少完善的质量评价技术,导致市场上产品的质量参差不齐,其真伪优劣的鉴别与评价也一直是未能很好解决的问题.该文综述了目前胶类药材在药材真伪鉴别、质量优劣评价的方法和技术的研究进展.关于胶类药材的真伪鉴别与质量评价的研究,目前主要集中在基于胶类药材的理化性质、微量元素、有机化学成分和生物遗传等4个方面的方法和技术研究.基于理化性质的方法有:热分析法、凝胶电泳法、等电聚焦电泳、红外光谱法、凝胶排阻色谱法、圆二色谱法等;基于胶类药材微量元素的方法有:原子吸收光谱法、X射线荧光光谱法、等离子体发射光谱法、可见分光光度法;基于有机化学成分的方法有:氨基酸的组成、含量的检测,气味、脂溶性成分、有机酸检测等;基于生物遗传学特点的方法有:DNA、多肽、氨基酸序列差异性分析等.总体上,由于胶类药材的成分组成(氨基酸、蛋白质、肽等)相对相似,其真伪和质量优劣评价的指标难以客观选择,各种鉴别评价的方法各有特点,但也有其局限性,提示应结合胶类药材的原料药材、生产工艺的特点,从鉴别评价指标及多种技术集成应用方面加强研究.

[目的]研究中华按蚊Anopheles sinensis气味结合蛋白1(AsinOBP1)与避蚊胺(N,N-diethylm-toluamide,DEET)的结合特性,并与埃及伊蚊Aedes aegypti AaegOBP1、致倦库蚊Culexquinquefasciatus CquiOBP1进行比较,分析与DEET互作的关键氨基酸残基.[方法]利用原核表达载体进行目的蛋白AsinOBP1的原核表达及纯化.以N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作为荧光探针,通过荧光竞争结合实验对AsinOBP1与DEET的结合特性进行分析,并比较AsinOBP1,AaegOBP1和CquiOBP1与DEET的结合能力,通过分子对接鉴定其与DEET互作的氨基酸残基.[结果]AsinOBP1能与DEET结合,解离常数为29.55 μmol/L.在相同实验条件下,CquiOBP1和AaegOBP1都能结合DEET,解离常数分别为17.15和12.81 μmol/L.与AaegOBP1和CquiOBP1相比,AsinOBP1结合DEET的能力最弱,AaegOBP1最强.分子对接显示,DEET分子结合在AsinOBP1二聚体靠近交界面的结合口袋边缘,结合口袋由α4,α5和α6上的氨基酸残基Leu-92,Leu-95,His-96,Leu-99,Ala-107,Met-108,Met-110,Gly-110,Cys-114,Leu-115,Trp-133,Met-108',Lys-112'和Leu-115'组成.比较分析发现3个蛋白中与DEET甲苯基团形成疏水性作用的氨基酸残基、与DEET羰基氧形成氢键的氨基酸残基是相同的,但与DEET二乙基侧链形成疏水性作用的氨基酸残基中,有一个位置存在差异,AaegOBP1是Leu,而AsinOBP1和CquiOBP1是Met残基.Leu的疏水性强于Met,可能是AaegOBP1与DEET的结合能力较强的原因之一.[结论]AsinOBP1能够结合DEET,不同蚊虫气味结合蛋白1与DEET的亲和力存在差异,进一步探索这些差异形成的原因对于阐明气味结合蛋白与DEET互作的模式具有重要的参考价值.

[目的]建立绿豆象Callosobruchus chinensis触角转录组数据库,挖掘绿豆象的基因数据.[方法]采用高通量测序平台(Illumina Hiseq)对绿豆象成虫触角进行转录组测序、序列组装及生物信息学分析.[结果]共获得51.10 Gb的clean data(NCBI SRA数据库登录号:SRP119884)及83 535条unigenes,长度在1 kb以上的unigenes有15 075条,unigenes的N50为1 492 bp.使用BLAST软件将绿豆象触角Unigene序列与公共数据库比对,共注释到22 148条unigenes,其中NR数据库注释的unigenes最多,为18 744条,且与赤拟谷盗Tribolium castaneum的相似基因最多,达39.57％.通过GO数据库注释,将unigenes功能分为细胞组分、分子功能与生物学过程三大类54个分支,其中参与代谢进程以及结合与催化活性的unigenes比例较大.KEGG代谢途径分析表明,9 084条unigenes形成289条代谢通路,其中核糖体代谢通路所含unigene最多,为516条.进一步基因注释分析筛选到140个嗅觉相关基因,包括12个气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,4个化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因,116个气味受体(odorant receptor,Or)基因,1个离子型受体(ionotropic receptor,IR)基因和7个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membraneprotein,SNMP)基因,并用FPKM值对基因表达量进行评估.[结论]本研究获得了绿豆象触角转录组数据,为进一步研究绿豆象的基因功能分析及嗅觉感受机制奠定分子基础.