目的 建立同时检测阿胶中马、牛、猪、骆驼、羊、鹿 6 种动物皮异源性成分的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法.方法 阿胶粉末加 1%碳酸氢铵溶液超声溶解,滤过,采用胰蛋白酶酶解 15 h.采用UPLC-MS/MS法,以阿胶特征肽段质荷比(m/z)539.8→924.3 和驴源特征肽m/z 570.5→698.1、马源寡肽A m/z 386.4→377.3、牛皮特征肽A m/z 641.2→726.3、猪皮特征肽m/z 774.5→1 035.7、骆驼皮特征肽m/z 603.8→281.8、羊皮特征肽m/z 553.0→450.8、鹿皮特征肽m/z 733.1→962.5 作为检测离子对,电喷雾电离(ESI)离子源、正离子模式进行多反应监测(MRM),对 10 批药用阿胶、6 批食品级阿胶样品进行质量评价.结果 所选各动物源特征肽段均只在对应动物皮胶中检出,方法专属性强;方法 灵敏度符合质量控制要求;酶解重复性、进样精密度及样品稳定性均满足方法学验证要求,结果的RSD均小于 9.0%(n=6).6批食用级阿胶样品中均未检出阿胶成分,判定主要成分为牛皮源、骆驼皮源、马皮源、猪皮源成分.8 批药用阿胶检出阿胶成分,其中 1 批阿胶成分含量偏低,1 批检出马皮源成分;2 批药用阿胶未检出阿胶成分,判定为假冒产品.结论 所建立的 6种动物皮胶检测方法的专属性强、灵敏度高,可用于阿胶鉴别及掺假杂皮胶的检测.

目的 以特征多肽为半抗原并制备多克隆抗体,鉴定阿胶原材料基原.方法 经文献调研及数据库比对筛选特征多肽,将多肽抗原与血蓝蛋白偶联并免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过ELISA、dot blot和Western blot分析与验证多克隆抗体的产生、效价及特异性.结果 筛选所得 5 个特征多肽序列均具有T细胞表位和B细胞表位,亲水性-1～0,二级结构大多为无规则卷曲.多肽抗原ECS1、ECS3～ECS5 在二次加强免疫后,效价分别为 1∶6 400、1 ∶400、1∶12 800 和1∶800.制备所得的多克隆抗体之间不产生交叉反应,而且多克隆抗体Ab-ECS3 与驴皮及其伪品蛋白的结合显现出较大差异.结论 以特征多肽为半抗原制备所得的多克隆抗体可通过Western blot对驴皮进行真伪鉴别,为胶类中药的基原鉴定提供了参考.

目的:建立阿胶中驴皮源成分的鉴别方法.方法:通过序列比对发现理论的驴皮特征肽,并利用纳升液相色谱-高分辨质谱进行确证阿胶特征肽GPTGEPGKPGDK.利用胰蛋白酶对阿胶样品进行酶解,利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ MS)对阿胶的专属性特征肽段进行检测.色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm),流动相为0.1％甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0～3 min,96％A;3～8 min,96％A→92％A;8～10 min,92％A→50％A;10～12 min,50％A;12～12.1 min,50％A→96％A;12.1～15 min,96％A),流速0.3 mL· min-1,柱温40℃,进样量5 μL;离子化模式为ESI+,进行多反应监测,选择阿胶特征分子离子峰m/z 380.71→374.82,m/z 380.71→493.56作为检测离子对.结果:10批阿胶样品均检出驴皮特征肽.结论:所建立的方法专属性强,可用于阿胶中驴皮源成分的鉴别.

患者男,70岁,因“外伤后左侧腰腹部疼痛伴全程肉眼血尿2h”入院.患者2h前在家做农活时被驴踢中左腹部后出现左腰腹部疼痛,呈持续性胀痛,程度较重,伴有全程肉眼血尿,为鲜红色.专科查体:腰腹部皮肤无破损,双肾区无隆起,未触及包块,左肾区叩击痛阳性,右肾区无叩击痛,双侧输尿管走行区无压痛,耻骨上膀胱区无隆起及压痛.超声检查提示:左肾大小11.7 cm ×6.0 cm,形态饱满,肾周可见不均质中低回声包饶,较宽处约1.8 cm,中下极肾实质内可见范围约5.1 cm×3.6 cm不均质回声包块,肾盂、肾盏无分离,右肾区未探及肾组织回声,双侧输尿管未见扩张,膀胱内可见范围约5.4cm×3.9 cm不均质回声包块,可移动.肝脏、胆囊、胰腺及脾脏超声未见异常,腹腔未见肠管扩张、明显异常包块及游离液体.血常规回报红细胞4.01×1012/L,血红蛋白130 g/L,红细胞压积38.4％,肾功能回报正常.

目的 建立鹿角胶饮片中牛皮源、驴皮源及鹿角胶成分同时检测方法 .方法 精密称定鹿角胶饮片粉末0.1 g,加1％碳酸氢铵溶液超声溶解、稀释、过滤,用胰蛋白酶酶解12小时,利用超高效液相色谱-串联质谱联用技术(UPLC-MS/MS)和多反应监测模式(MRM)分别检测黄明胶特征肽段离子对(m/z)641.3→726.2,783.3,阿胶特征肽段离子对(m/z)539.8→612.4,924.0,鹿角胶特征肽段离子对(m/z)765.4→554.0,733.0.色谱柱为BEH-C18,以乙腈—0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱.分别考察上述三种特征肽段离子对的专属性,并用逐级稀释法确定方法检出限.用所建方法检测10批市售鹿角胶饮片.结果 黄明胶、阿胶、鹿角胶三种对照药材在所建方法下保留时间分别为3.6分钟、6.2分钟和10.9分钟,无基质干扰,检测限分别为0.1,2.0,1.0 mg/L,对照药材混合溶液进样6次,鹿角胶峰面积RSD为2.1％,黄明胶峰面积RSD为3.7％,阿胶峰面积RSD为2.8％,方法重复性良好.将所建方法应用于10批市售鹿角胶饮片的检测分析,1批结果为不合格(检出牛皮源成分).结论 所建方法专属性强、灵敏度高,实现了鹿角胶饮片中主成分鉴别与非法添加成分检查的同时检测,进一步提高检验效率,可有效控制鹿角胶质量.

目的 探讨3种胶类驴皮、龟甲、鹿角在加工成中药的过程中蛋白质的动态变化规律.方法 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分别对3种胶类原有蛋白质组成进行分析,按照《中国药典》规定的方法加工成阿胶、龟甲胶和鹿角胶,并分析在不同煎煮时间收集的煎出液以及最终产品中的蛋白质组成,最后通过比较电泳图谱分析蛋白质在加工过程中的动态变化规律.结果 驴皮、龟甲、鹿角中含有丰富的蛋白质类化学成分,在10 ～250 kDa区间均有分布;随着煎煮时间的延长以及辅料的加入,蛋白质在泳道中逐渐呈现弥散现象.此外,阿胶和鹿角胶中蛋白质的相对分子质量介于15～250 kDa,甚至更高,而龟甲胶则基本上小于50 kDa,分布区域有明显不同.结论 该技术可用于考察胶类中药加工过程的规范程度,对胶类中药的质量控制有一定的参考价值.

目的:采用细胞色素C氧化酶亚基1(cytochrome C oxidase subunit 1,COⅠ)基因片段序列鉴定的方法鉴别中药阿胶的原料驴皮及其混伪品马皮、骡皮、牛皮.方法:优化DNA提取试剂盒的通用方法进行总DNA的提取,针对马科动物驴的基因序列变异位点优化COⅠ通用引物及PCR扩增条件,PCR扩增产物双向测序,测得的序列与GenBank下载的基因序列Blast比对分析样品的基原;采用Mega 6.0软件计算序列的碱基组成、种内和种间K2P(Kimura-2-parameter)的遗传距离,采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统树,进一步对驴皮及其混伪品进行基原鉴别.结果:22份来自马科和牛科动物的驴、马、牛的皮样品的基因序列与GenBank序列Blast比对结果一致性均大于99％.采用邻接法构建的系统树结果显示驴、马、牛的皮样品具有较好的单系性,均分别独立聚为1个分支,可以显著区分;牛科和马科动物样品的K2P种间平均遗传距离均远大于种内平均遗传距离.结论:利用优化后的COⅠ片段扩增引物及PCR反应程序可作为鉴别阿胶原料DNA条形码物种鉴定的有效方法,为阿胶原料的真伪鉴别提供了科学的鉴定方法.

阿胶作为我国传统的补益药,近年来需求剧增,其质量问题长期受到关注.阿胶主要原料驴皮与近缘动物皮成分相似,缺乏专属性鉴别成分,鉴别难度大,阿胶的质量评价研究长期以来都是难点和热点.本文综述了近年来阿胶的质量评价方法,认为肽图法、 分子鉴定法是目前比较有效的鉴别方法,而现有定量分析方法仍有较大缺陷,基于此,下一步应进一步挖掘阿胶质量标志物特别是多肽进行定量分析,并结合药效进行有效性评价,同时做好阿胶各个生产环节的质量监控和标准化,进一步完善阿胶质量评价方法.

目的 基于光学手段建立一种快速检测驴皮的方法.方法 用哈氏切片器对待测驴皮、马皮和牛皮附属物毛进行切片,采用光学显微镜观察各动物毛纤维表面及横切面的显微结构差异.结果 驴皮、马皮和牛皮附属物毛切显微镜观察结果存在明显差异,可作为毛皮种类的鉴别依据.结论 该方法操作简便、快速准确,可用于驴皮的真伪鉴别.

目的:建立基于生物信息技术和液质联用技术识别特征肽鉴别阿胶的新方法.方法:利用生物信息技术对驴皮、牛皮和猪皮I型胶原蛋白α1链氨基酸序列进行同源性比对发现3种皮类胶原蛋白氨基酸序列存在差异,通过生物学软件模拟胰酶酶解,分析比对驴皮、牛皮、猪皮来源Ⅰ型胶原蛋白α1链酶解肽段,然后通过实验对样品前处理条件进行系统摸索,采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)进行验证.结果:筛选出12个驴皮的特异性肽段,鉴定出1个与预测结果一致的驴皮特异性肽段,其质荷比(m/z)为766.4,分子量为1 530.802 2,对应的多肽序列为GEAGPAGPAGPIGPVGAR,利用特征肽段对10组阿胶样品进行鉴定.结论:生物信息技术结合UPLC/Q-TOF-MS检测出的驴皮特征肽可有效、特异、准确地对阿胶药材进行专属性鉴定.