目的:利用MLPA技术结合熔解曲线法建立一种能鉴别山药及其常见混伪品的新方法.方法:以山药、参薯、木薯、番薯为研究对象,针对四个物种的matK序列分别设计MLPA特异性探针,通过DNA变性、杂交、连接、扩增及熔解反应等步骤,建立MLPA-熔解曲线鉴别体系,利用各样品熔解曲线中特异性峰(Tm值)的差异实现不同物种的鉴定.结果:27份样品中,山药Tm值为78.3 ℃,参薯Tm值为79.9℃,木薯Tm值为81.2℃,番薯Tm值为82.9℃,且相互之间没有交叉干扰.该法对山药、参薯、木薯、番薯各自单独的最低检测限为0.1 ng/μL;对相互混淆掺伪的最低有效检出率为5％.27份样品的检测结果均与测序结果一致.结论:MLPA技术结合熔解曲线法具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点,具有进一步推广应用的潜力.

目的:建立差示扫描量热法(DSC)鉴别区分天然没药、胶质没药、没药炮制品、没药混伪品.方法:收集不同基原、炮制品、混伪品的没药样品,通过考察升温范围、升温速率、粒度大小等因素对没药DSC试验条件的影响,在优化条件下应用差示扫描量热仪对没药各样品进行差热图谱扫描、对比分析.结果:DSC试验优化条件为升温范围-25～550 ℃、粒度大小100目、升温速率50 ℃/min;130 ℃附近的吸热峰与330 ℃附近的放热峰为没药的特征峰.天然没药、胶质没药在130 ℃和330 ℃位置特征峰的平均温度、热焓值均有明显差异,天然没药在两位置的热焓值均明显低于胶质没药.通过比对特征峰可以清晰地鉴别出伪品(松脂、枫香脂)在130 ℃和330 ℃附近位置均无该特征峰,混伪品枫香脂在10 ℃有吸热特征峰,混伪品松脂在150 ℃附近有明显的放热峰;醋制天然没药在180 ℃与240 ℃附近特征峰的热焓值均比天然没药低.结论:DSC试验可快速准确鉴别天然没药、胶质没药、伪品枫香脂及松脂;DSC可快速区分醋制没药与没药;130 ℃吸热峰、330 ℃放热峰为没药特征峰.

目的 建立重楼及其混伪品的近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIRS)快速鉴别方法.方法 采用NIRS仪获取样品光谱数据,结合主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)、线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)、人工神经网络机器学习算法(artificial neural network,ANN)和二维红外光谱(2D-IR),探讨NIRS技术在重楼及其混伪品快速鉴别的可行性.结果 重楼及其混伪品的NIRS光谱吸收峰的峰形整体相似,但在峰数和峰强方面均存在一定差异.PCA和OPLS-DA判别模型可将重楼及其混伪品区分,但模型预测能力差(Q2＜0.5);LDA 模型可将滇重楼与其他物种进行区分,但无法区分七叶一枝花的部分样本;ANN模型识别准确率达 100.0%,不同物种的 2D-IR图谱在 5 897～5 600 cm-1 和 4 497～4 200 cm-1 差异显著.结论 重楼及其混伪品的化学信息差异明显,不可混用.NIRS结合ANN模型或 2D-IR方法可用于重楼及其混伪品的快速鉴别.

目的 建立腺毛菊苣Cichorium glandulosum种子(菊苣子药材)和混伪品菊苣Cichorium intybus种子HPLC指纹图谱及多成分含量测定,并结合化学模式识别法对二者进行分析比较,为其资源利用开发和进一步的质量控制研究提供参考.方法 采用YMC-PACK ODS-A色谱柱,以 0.2%磷酸溶液(A)-甲醇(B)为流动相梯度洗脱,体积流量为 1.0 mL/min,检测波长为 254 nm,柱温为 40℃,进样量为 5 μL.利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 版)》建立 19 批腺毛菊苣种子和 4 批菊苣种子样品的HPLC指纹叠加图谱并分析相似度,通过对照品比对指认,确定化学成分并进行含量测定,使用SPSS 20.0 和SIMCA-P 14.1 软件进行聚类分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)分析和正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)分析,对不同批次样品进行质量评价.结果 建立了 19 批腺毛菊苣种子和 4 批菊苣种子HPLC指纹叠加图谱,并确定 19 个共有峰,通过对照品比对指认了其中 8 个色谱峰;建立了绿原酸、秦皮乙素、1,4-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸 A、1,5-二咖啡酰奎宁酸含量测定方法;指纹图谱相似度在0.915～0.998;OPLS-DA分析与PCA分析结果一致,可将样品分为 3 组,并筛选出1,5-二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、绿原酸、菊苣酸 4 个差异性成分.结论 通过HPLC指纹图谱结合化学模式识别方法,建立了一种简单可靠的菊苣子药材质量评价方法,为菊苣子药材的质量评价和资源化利用提供依据.

基于多肽组学技术系统分析鸡内金及其混伪品的特征肽并建立检测方法,用于鉴别鸡内金与其混伪品鸭内金、鹅内金、鸽内金.采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive Obitriap-MS)技术结合多元统计分析对鸡内金及其混伪品多肽成分进行初步分析,通过pNovo软件结合人工确认图谱的方式鉴定多肽成分的结构,并合成鸡内金特征肽对照品进行验证;利用LC-MS/MS,针对鸡内金特征肽LESY对提取方式、提取时间、提取溶剂和溶剂体积等样品前处理方法进行了优化,以m/z 511.24→269.11 和511.24→243.13 作为检测离子,采用ESI+模式进行了多反应监测(MRM)定性定量分析,测定得 16 批鸡内金中鸡内金特征肽LESY的质量分数为 55.03～113.36 μg·g-1;此外,针对常见混伪品多肽RDPVLVSR,以m/z 471.28→785.45 和 471.28→670.41 作为检测离子,建立了鸡内金常见混伪品的LC-MS/MS定性检测方法.该研究建立的鸡内金及其混伪品特征肽检测方法操作简便,可快速、准确区分鸡内金及其混伪品,具有良好的专属性、稳定性及耐用性,可为鸡内金及其他动物类中药的鉴别及质量控制提供参考.

目的 建立一种龟甲配方颗粒高分辨熔解曲线(HRM)技术鉴别方法.方法 根据乌龟Chinemys reevesii及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunitⅠ,COI)基因序列上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点设计鉴别引物,扩增产物直接进行HRM分析,并优化反应体系,根据最佳条件进行适用性验证.结果 在模板DNA质量浓度为0.62～374.88 ng/μL、引物浓度为0.1～0.4 μmol/L、退火温度为62℃、循环数为45个的条件下,龟甲饮片和配方颗粒的熔解曲线为单峰,其Tm均值分别为(82.39±0.09)、(82.38±0.05)℃,而混伪品和醋龟甲配方颗粒未有扩增.结论 该研究建立的高分辨熔解曲线鉴别方法可快速鉴别龟甲原料和配方颗粒的真伪,以及区分其生品和炮制品配方颗粒,为龟甲配方颗粒的质量标准研究提供了理论依据.

目的:建立能够准确鉴别诃子、绒毛诃子及其混伪品的分子鉴定方法.方法:对诃子、绒毛诃子及其混伪品的新鲜果实进行烘干,观察其干燥前后的形态;提取样品DNA,采用DNA条形码内转录间隔区 2(ITS2)序列和psbA-trnH序列进行聚合酶链式反应扩增并测序,采用DANMAN 7、MAGE 6 软件对测序结果进行序列比对,计算Kimura 2-paramete遗传距离,并构建邻接法系统发育树.结果:形态观察发现,诃子、绒毛诃子果实干燥前后与混伪品有较大的差异,可以通过形态差异进行鉴别;DNA条形码序列表明,诃子和绒毛诃子ITS2 序列基本一致,仅发现 4 个单核苷酸多态性位点,但不能由此对两者进行区分;诃子和绒毛诃子的psbA-trnH序列存在 2 处明显差异,可对两者进行准确区分;绒毛诃子中存在 2 种类型的单倍型,其明显差异在于是否在psbA-trnH序列上存在 1 段 16 bp的串联重复序列;混伪品与诃子、绒毛诃子之间具有较大的psbA-trnH序列差异,可直接在美国国家生物技术信息中心比对进行区分;对市场上流通的诃子炮制品进行鉴定发现,其多为 2 种单倍型绒毛诃子,且存在毛诃子混伪的情况.结论:利用psbA-trnH序列可准确鉴别诃子、绒毛诃子及其混伪品,发现绒毛诃子中存在 2种类型的单倍型.

目的:利用DNA条形码ITS2碱基序列及其二级结构对菟丝子及其混伪品金灯藤进行鉴定.方法:从安徽亳州药材市场收集10份菟丝子、5份南方菟丝子、5份金灯藤样品,提取基因组DNA后,利用ITS2序列扩增引物进行PCR及测序,并从GenBank下载菟丝子、南方菟丝子、金灯藤ITS2序列.利用MEGA 11.0对序列进行比对分析,计算种内、种间遗传距离,利用邻接法(NJ)构建系统聚类树,通过数据库预测ITS2二级结构.结果:菟丝子、南方菟丝子、金灯藤构建的NJ树分别聚为一支,基于ITS2碱基序列的种间遗传距离能准确鉴别菟丝子、南方菟丝子、金灯藤;菟丝子、南方菟丝子、金灯藤的二级结构在整体上有较大区别,能够明显区分.结论:基于ITS2序列可以准确地鉴别菟丝子及其混伪品.

目的:建立药用蛇及其水提物的DNA微型条形码鉴别方法.方法:通过比对药用蛇及常见11种混伪品的16S rRNA序列,建立约220 bp的蛇类DNA微型条形码,并与16S rRNA标准条形码比较,对药用蛇原料及水提物进行测序鉴定.采用MEGA-X软件分析遗传距离并以邻接法(NJ)构建系统发育树.结果:DNA微型条形码引物对药用蛇原料及水提物的扩增率为100％,鉴定率为100％.药用蛇及其混伪品的种内平均遗传距离均小于种间平均遗传距离,且各物种在NJ系统发育树中具有良好的单系性,并与16S rRNA标准条形码原料的鉴定结果一致.结论:该研究建立的蛇类DNA微型条形码可有效实现药用蛇原料及水提物等制品的物种鉴别,为保障蛇类原料、临床汤剂及配方颗粒等药品的安全性和有效性提供了技术支撑.

动物源中药材是祖国医药学遗产中的重要组成部分,具有活性成分强、疗效确切等特点.近年来动物源中药材的需求量不断上升,但药用动物的养殖规模远没有达到市场需要,动物源中药材大部分为贵重紧缺药材,市场上混伪品、替代品的不断出现给动物源中药材的准确鉴定带来极大困难,严重影响了动物源中药材的应用效果和用药安全.该文综述了从南朝宋到清末动物源中药材鉴定的历史和现代动物源中药材鉴定技术发展成果,以为动物源中药材鉴定从业者提供相关技术方法与总体思路.