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实验室监测在传染病预警中的应用及思考
编辑人员丨6天前
新型冠状病毒肺炎疫情的暴发流行,使全社会重新认识了传染病发生、流行及防控所面临的巨大挑战,即便是当前对传染病防范的认知、应对技术和社会经济条件已有历史上最好的基础。在传染病的监测预警中,研究和利用各类传染病发生与传播相关因素的数据,以期在传染病发生的早期甚至发生前识别疫情信号,成为传染病防控研究的重要命题。病原体是传染病发生的原因,所以以病原学为核心的实验室监测是传染病预警体系的重要组成部分。我国目前已经初步建成了基于国家致病菌识别网的细菌性传染病实验室监测预警系统,其核心是识别病原、识别暴发、识别来源,在鼠疫、霍乱、流脑等细菌性传染病的早期发现、溯源和精准防控中起到重要作用。本期重点号围绕实验室监测在细菌性传染病预警和防控中的作用,从流行和暴发菌株特征分析、与流行病学调查的联合应用、与常规病例监测体系的融合等方面开展研究,体现了实验室监测在传染病风险评估和疫情调查中的作用,同时对实验室监测预警技术及应用场景进行了综述和展望,以期为推动我国传染病监测预警体系的跨越发展提供新思维。
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编辑人员丨6天前
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新型冠状病毒灭活疫苗对Beta和Delta变异株的交叉中和活性
编辑人员丨6天前
目的:评估新型冠状病毒灭活疫苗免疫人群和小鼠血清对变异株(Delta株和Beta株)的交叉中和活性。方法:各取20份人群常规两剂基础免疫血清、三剂加强免疫血清和两剂小鼠免疫血清作为实验材料,采用新型冠状病毒原型株、Delta和Beta变异株3株病毒,在生物安全三级实验室中采用微量中和试验检测中和抗体。通过分析不同稀释度血清对固定剂量病毒的中和活性,计算血清阳性率和抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT),评估免疫血清的交叉中和水平。结果:人免疫血清对不同变异株的阳性率均大于95%;基础免疫后,接种者血清对原型株、Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别为109、41和15,与原型株比较,针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.7倍和7.3倍;加强免疫后,接种者血清对原型株、Delta和Beta株的中和抗体GMT分别为446、190和86,与原型株比较,针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.3倍和5.2倍。小鼠免疫血清对不同变异株的阳性率均为100%;对原型株、Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别为2 037、862和408,与原型株比较,针对Delta和Beta变异株的中和抗体GMT分别下降2.4倍和5.0倍。结论:新型冠状病毒灭活疫苗免疫后的人群和小鼠血清均可对Delta和Beta变异株产生一定水平的中和保护,且人群加强免疫后可产生更高水平的中和抗体和交叉中和抗体,为该疫苗的临床应用和保护效果评估提供了重要参考。
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编辑人员丨6天前
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新型冠状病毒和甲型流感病毒双价DNA疫苗的构建与免疫原性研究
编辑人员丨6天前
目的:构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)和甲型流感病毒双价DNA疫苗,并在小鼠模型中评价其免疫原性。方法:将SARS-CoV-2 Beta突变株S1蛋白编码序列和甲型流感病毒Cambodia (H3N2)株HA蛋白编码序列进行密码子优化合成,采用Over-lapping PCR方法,将两个编码基因通过自裂解2A肽(self-cleaving 2A peptides)序列连接成S1-2A-HA片段,构建能同时表达S1蛋白和HA蛋白的双价DNA疫苗,命名为pVRC-S1-2A-HA,间接免疫荧光和Western blot验证S1蛋白和HA蛋白的表达。将DNA疫苗以肌肉注射加电转途径(IM+EP)免疫BALB/c小鼠,间接ELISA、假病毒中和试验和血凝抑制试验检测小鼠体液免疫应答,IFN-γ ELISPOT、胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)和CBA法检测小鼠细胞免疫应答。结果:双价DNA疫苗pVRC-S1-2A-HA可以同时表达S1蛋白和HA蛋白,初次免疫后能够显著诱导小鼠产生针对S1蛋白的特异性细胞免疫和针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体;加强免疫后特异性免疫应答都显著增强,针对S1蛋白的特异性IgG结合抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)提高至3 251,细胞免疫提高至1 238 SFC/10 6个细胞,针对HA蛋白的特异性IgG结合抗体GMT达到45 407。ICS法检测到疫苗加强免疫可诱导小鼠CD4 +和CD8 +T细胞产生IL-2、IFN-γ、TNF-α;CBA结果显示单针免疫后小鼠脾细胞分泌多种细胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ)。 结论:本研究成功构建能同时表达SARS-CoV-2 S1蛋白和甲型流感病毒H3N2亚型HA蛋白的双价DNA疫苗,该疫苗可诱导产生针对S1蛋白和HA蛋白的特异性体液免疫和细胞免疫应答,具有较好的研发与应用前景。
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编辑人员丨6天前
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乙型肝炎病毒核心颗粒展示新型冠状病毒刺突蛋白B细胞线性表位及其免疫原性分析
编辑人员丨6天前
目的:获得展示新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白B细胞线性表位的乙型肝炎病毒衣壳样颗粒(capsid-like particles, CLPs)并评价其免疫原性。方法:将SARS-CoV-2的4条B细胞线性表位(M1、S1-57、S14P5和S21P2)置换乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein, HBc)第80位丙氨酸。在大肠埃希菌BL21 Star (DE3)中诱导表达这4种线性表位和HBc的重组融合蛋白(M1-HBc、S1-57-HBc、S14P5-HBc和S21P2-HBc)。SDS-PAGE、Western blot和非变性琼脂糖凝胶电泳(native agarose gel electrophoresis, NAGE)鉴定表达产物。蔗糖密度梯度超速离心纯化CLPs并经Western blot验证其抗原性。用纯化的CLPs免疫BALB/c小鼠,通过ELISA测定血清中的抗体滴度。结果:重组融合蛋白M1-HBc和S1-57-HBc自组装成M1-CLP和S1-57-CLP,S1-57-CLP免疫小鼠后靶向S1-57多肽的抗体滴度高达1∶1 000 000。结论:在原核系统中成功表达了展示SARS-CoV-2 M1或S1-57线性表位的乙型肝炎病毒CLPs,S1-57-CLP具有良好的免疫原性,为研制SARS-CoV-2新型诊断试剂和疫苗提供了新思路。
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编辑人员丨6天前
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疫情防控专题:新型冠状病毒相关蛋白ACE2和TMPRSS2在眼部组织表达的实验研究
编辑人员丨6天前
本文于2020年4月22日优先发布于中华眼科杂志官网目的:探讨眼部组织新型冠状病毒侵染和激活关键蛋白人血管紧张素转换酶2(ACE2)和跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)的情况,明确新型冠状病毒在眼部的侵染基础。方法:实验研究。选取30只小鼠,按性别、年龄、是否诱导糖尿病模型分为雄性组、雌性组、老年组、糖尿病组及糖尿病对照组,每组6只。使用荧光定量PCR分析小鼠结膜、角膜、泪腺、虹膜、晶状体、视网膜ACE2基因和TMPRSS2基因表达情况,并与肺脏、心脏、肾脏、肝脏中两个基因的表达量进行比较。使用免疫组化染色分析了小鼠各组织中ACE2和TMPRSS2蛋白的分布和表达情况。另取山东省眼科研究所红十字眼库接收的符合捐献条件的志愿者角膜及结膜组织切片,与小鼠眼部ACE2蛋白和TMPRSS2蛋白表达进行验证比较。同时通过分析已发表的人眼部组织转录组数据库,比较人角膜和结膜中ACE2和TMPRSS2基因的表达情况。对不同性别、年龄、及糖尿病条件下小鼠眼表组织的ACE2基因表达变化进行分析,采用独立样本 t检验对数据进行统计学分析。对数据库中人角膜和结膜组织两种基因表达分析,采用Mann-Whitney U检验进行统计学分析。 结果:在小鼠6种眼部组织中,结膜ACE2基因和TMPRSS2基因表达量最高,但均低于肾脏和肺脏;ACE2和TMPRSS2蛋白阳性染色集中于结膜上皮、角膜上皮和泪腺腺泡。ACE2基因的表达具有性别差异,在雌性小鼠结膜和角膜的表达显著低于雄性小鼠,分别为雄性相应组织的43% ( t=3.269, P=0.031)和63% ( t=4.080, P=0.015);糖尿病小鼠结膜和泪腺中的ACE2基因表达略高于非糖尿病小鼠,分别为1.21倍和1.10倍 ( P>0.05);不同年龄小鼠ACE2基因表达差异无统计学意义。与小鼠相似,人结膜ACE2和TMPRSS2基因表达量显著高于角膜( P=0.007),分别约为角膜上皮基因表达量的5.74倍和12.84倍。 结论:结膜中ACE2和TMPRSS2的表达在6种检测的眼部组织中最高,提示结膜是新型冠状病毒眼部感染的主要靶组织。 (中华眼科杂志,2020,56:438-446)
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编辑人员丨6天前
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SARS-CoV-2受体ACE2的单细胞RNA表达谱在小鼠呼吸道中的表达分布
编辑人员丨6天前
目的:了解SARS-CoV-2受体血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)在小鼠呼吸道及口腔(包括舌头和颊黏膜上皮)的分布。方法:利用单细胞公共数据库和最新的单细胞RNASeq技术,对小鼠气管,肺脏进行单细胞数据可视化分析,对颊黏膜上皮进行重新聚类分析。结果:小鼠肺脏少量II型肺泡上皮细胞(AT2)表达ACE2,与人体相似,气管中各类型细胞散在表达ACE2,在小鼠舌头的角质形成细胞(41.74%)表达ACE2,在小鼠的分化期口腔颊黏膜上皮细胞中表达ACE2,并且与肺脏ACE2+ AT2相同,也表达病毒进程相关基因,部分基因呈现特异性表达。结论:冠状病毒可能定植于口腔中,并通过舌头黏膜等口腔器官分泌物进行传播。
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编辑人员丨6天前
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原核表达新型冠状病毒受体结合蛋白的制备及免疫原性研究
编辑人员丨6天前
目的:探索原核表达新型冠状病毒受体结合蛋白(RBD)的制备方法,并对其在小鼠体内的免疫原性进行评价。方法:用大肠埃希菌表达重组新型冠状病毒RBD,进行纯化、透析复性,比较了RBD复性前后的结构表征和抗原活性变化,最后将制备所得重组RBD免疫Babl/c小鼠,检测免疫小鼠体内的体液免疫和细胞免疫变化情况。结果:完成了大肠埃希菌表达的新型冠状病毒重组RBD的制备。复性前后,RBD的自发荧光波长发生蓝移现象,从(363.33±0.47)nm蓝移至(333.00±0.82)nm,蛋白形状从无序状态折叠为(9.55±0.39)nm的颗粒,复性后RBD与ACE-2的结合活性是复性前的128倍。活病毒中和抗体检测结果显示:血清对原型株的滴度几何平均数为136.70,对贝塔株为101.59,两者无统计学差异( t=0.41, P=0.700)。试验组小鼠脾淋巴细胞产生的分泌特异性IFN-γ的效应T细胞为(308.50±144.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞,低于对照组[(3.75±3.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞],差异有统计学差异( t=4.72, P=0.010)。 结论:成功制备原核表达的新型冠状病毒重组RBD,通过体外复性折叠,能够产生良好、全面的免疫原性。
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编辑人员丨6天前
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CpG1826对重组新型冠状病毒亚单位疫苗的协同免疫增强效果研究
编辑人员丨6天前
目的:以CpG1826作为疫苗佐剂评价其与铝佐剂对大肠埃希菌表达的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)亚单位疫苗免疫原性的协同增强效果。方法:利用大肠埃希菌高效表达SARS-CoV-2亚单位抗原,纯化后加入CpG1826和铝佐剂。将BALB/c小鼠随机分成铝佐剂疫苗组、CpG+铝佐剂疫苗组和空白对照组,每组18只,于0、7和14 d进行腹腔注射免疫。分别于首针免疫后7、14和28 d采血和取脾检测小鼠血清IgG水平、中和抗体水平以及小鼠脾细胞上清中IFN-γ细胞因子水平。结果:在首针免疫28 d后,3组小鼠的IgG、结合抗体抑制率和中和抗体水平差异均有统计学意义( F=21.440、159.400和8.470, P均<0.05),其中CpG+铝佐剂疫苗组分别为6.91±0.20、(91.01±4.60)%和65.33±51.70,均高于铝佐剂疫苗组( t=2.892、2.441和2.703, P均<0.05)。在首针免疫7、14和28 d后,3组的特异性IFN-γ的效应T细胞数比较差异有统计学意义( F=25.360、36.990和660.400, P均<0.01),CpG+铝佐剂疫苗组分别为179.68±69.26、395.58±139.64、563.50±43.79,均高于铝佐剂疫苗组( t=3.969、5.292和22.310, P均<0.01)。 结论:CpG1826能和铝佐剂协同增强大肠埃希菌表达的SARS-CoV-2亚单位疫苗诱导的体液及细胞免疫应答水平,显著提高其免疫原性,具有较强的临床意义。
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编辑人员丨6天前
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新型冠状病毒重组RBD重复串联三聚体蛋白疫苗作为加强针可在小鼠中诱导较强的免疫应答和交叉中和反应
编辑人员丨6天前
目的:研究新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针的效果。方法:选择新型冠状病毒受体结合域(receptor binding domain,RBD)进行3次重复拷贝串联作为免疫原(RBD-sc-trimer),利用昆虫杆状病毒表达系统表达RBD-sc-trimer重组蛋白,并用His-标签亲和纯化。纯化产物进行Western blot鉴定并在体外验证其与人血管紧张素转化酶2(human angiotensin converting enzyme 2, hACE2)的结合能力。在BALB/c小鼠模型中进行免疫原性检测(结合抗体及中和抗体),同时与RBD二聚体(RBD-Fc)、RBD单体(RBD)和刺突蛋白三聚体(S trimer)进行比较。结果:RBD-sc-trimer的免疫原性优于RBD-Fc和RBD,并能达到S trimer的水平。RBD-sc-trimer能诱导产生较强的Th1偏向型抗体应答,并能交叉中和新型冠状病毒Beta、Delta和Omicron变异株,其中相较于原始毒株,针对Omicron的中和抗体水平仅下降9.1倍,远低于RBD-Fc(68.4倍)和S trimer(70.8倍)组的下降水平。结论:本研究制备的新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针可以诱导较强以及更为广谱的体液应答,能更好地应对变异株,具有较好的研发与应用前景。
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编辑人员丨6天前
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新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域在毕赤酵母中的分泌表达优化及其免疫原性研究
编辑人员丨6天前
目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD),并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段,将其构建至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测,筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺,包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数),实现RBD蛋白的高效表达,并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺,即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h,实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中,采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白,且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。
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编辑人员丨6天前
