目的:以CpG1826作为疫苗佐剂评价其与铝佐剂对大肠埃希菌表达的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）亚单位疫苗免疫原性的协同增强效果。方法:利用大肠埃希菌高效表达SARS-CoV-2亚单位抗原，纯化后加入CpG1826和铝佐剂。将BALB/c小鼠随机分成铝佐剂疫苗组、CpG+铝佐剂疫苗组和空白对照组，每组18只，于0、7和14 d进行腹腔注射免疫。分别于首针免疫后7、14和28 d采血和取脾检测小鼠血清IgG水平、中和抗体水平以及小鼠脾细胞上清中IFN-γ细胞因子水平。结果:在首针免疫28 d后，3组小鼠的IgG、结合抗体抑制率和中和抗体水平差异均有统计学意义（ F=21.440、159.400和8.470， P均<0.05），其中CpG+铝佐剂疫苗组分别为6.91±0.20、（91.01±4.60）%和65.33±51.70，均高于铝佐剂疫苗组（ t=2.892、2.441和2.703， P均<0.05）。在首针免疫7、14和28 d后，3组的特异性IFN-γ的效应T细胞数比较差异有统计学意义（ F=25.360、36.990和660.400， P均<0.01），CpG+铝佐剂疫苗组分别为179.68±69.26、395.58±139.64、563.50±43.79，均高于铝佐剂疫苗组（ t=3.969、5.292和22.310， P均<0.01）。 结论:CpG1826能和铝佐剂协同增强大肠埃希菌表达的SARS-CoV-2亚单位疫苗诱导的体液及细胞免疫应答水平，显著提高其免疫原性，具有较强的临床意义。

目的:评价犬肾细胞基质四价流感裂解疫苗(MDCK-Va)配伍不同佐剂后的免疫原性。方法:将高、中、低剂量的MDCK-Va和鸡胚基质四价流感裂解疫苗(egg-Va)原液分别肌肉免疫BALB/c小鼠2次，间隔3周，小鼠眼静脉采血，分离血清，血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验检测抗体效价。不同剂量的MDCK-Va分别配伍QS21、AddVax、PolyI∶C、CpG ODN 1826以及AddVax/PolyI∶C(Add/Poly)联合佐剂，免疫小鼠，初次免疫21 d后，小鼠眼静脉采血，HI和微量中和(microneutralization，MN)试验检测抗体效价，同等剂量加强免疫21 d后，再次采血检测抗体效价。10 μg MDCK-Va配伍上述佐剂，加强免疫5 d后，取小鼠脾脏检测脾指数和脾细胞分型。结果:MDCK-Va诱导的各型别(H1N1、H3N2、B/Victoria和B/Yamagate)的血清效价均非劣效egg-Va诱导的血清效价。QS21/Va、AddVax/Va、PolyI∶C/Va、CpG ODN 1826/Va，以及Add/Poly/Va诱导的小鼠血清HI抗体效价均高于MDCK-Va，尤其是QS21/Va和Add/Poly/Va诱导的保护性效价，其差异具有统计学意义。对于H1N1疫苗，血清HI抗体和MN抗体之间的Pearson相关系数为0.737~0.910；对于H3N2亚型，HI抗体和MN抗体的Pearson相关系数为0.839~0.947。QS21/Va组具有明显的脾指数增高，但淋巴细胞占比降低。QS21/Va和Add/Poly/Va对小鼠脾脏中性粒细胞和CD4/CD8细胞的刺激明显强于其他佐剂。结论:Add/Poly/Va组对MDCK-Va具有较强的免疫增强作用，可作为MDCK-Va的候选佐剂。HI和MN试验检测的抗体具有很强的正相关性。

目的:探究HCA587/MAGE-C2蛋白在不同免疫策略下诱导抗原特异性免疫应答的能力及在小鼠模型中的抗肿瘤作用.方法:HCA587蛋白与弗氏完全佐剂(CFA)/弗氏不完全佐剂(IFA)、不同剂量CpG ODN 1826(CpG)联合免疫C57BL/6J小鼠,比较不同方案诱导的细胞免疫和体液免疫水平.酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测脾细胞产生IFN-γ的频率;ELISA检测抗HCA587特异性抗体;流式细胞术分析胞内细胞因子染色(ICCS).将B16-HCA587肿瘤细胞皮下接种于C57BL/6J小鼠右侧胁腹部建立荷瘤小鼠模型,采用免疫比较方案中细胞和体液免疫应答最强的策略进行治疗;游标卡尺测量肿瘤体积;Log-rank检验评估生存曲线.结果:HCA587蛋白联合CFA和50 μg CpG免疫方案诱导出能分泌抗原特异性IFN-γ的脾细胞频数最多,诱导抗HCA587的IgG抗体滴度最高,诱导出的IFN-γ+CD4+T细胞比例最高(P<0.05).肿瘤治疗模型中,HCA587蛋白联合CFA和50 μg CpG可显著抑制肿瘤生长(P=0.026),但Log-rank检验显示其对生存期无明显影响(P>0.05).结论:佐剂CFA和50 μg CpG联合组成的HCA587蛋白疫苗在小鼠模型中能诱导强大的细胞免疫应答和体液免疫应答,并具有一定抗肿瘤作用,为肿瘤抗原蛋白疫苗临床前研究提供了新的实验数据.

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligonucleotide,CpG ODN)是由人工合成的含有非甲基化CpG的ODN,在疾病预防及临床治疗领域具有广阔的应用前景.其中B型CpG ODN因具有强免疫刺激作用等特点被广泛用于疫苗研究中,且部分基序已进入临床试验阶段.随着临床治疗中的细菌耐药性问题日益严重,以B型CpG ODN为佐剂开展细菌性疫苗研发成为研究热点.本文对现有的B型CpG ODN 1826、2006、2007和1668等基序在细菌性疫苗中的研究现状及相关研究进展作一综述,以期为后续细菌性疫苗的开发及应用提供参考.

目的:探讨两种CpG ODN序列对急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型的免疫治疗作用.方法:通过注射WEHI-3细胞构建急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型,分别皮下注射PBS无菌缓冲液、CpG1826、CpG Seq14,观察治疗后各组小鼠的一般状况、生存时间、瘤结节生长、病理切片等,综合评价两种CpGODN的治疗效果.结果:皮下接种1×106个WEHI-3细胞,成功建立急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型.肿瘤组平均生存时间20.87天,CpG 1826组32.60天,CpG Seq14组28.35天,两种CpG治疗组小鼠平均存活时间明显较肿瘤组长,P＜0.05;实验初期,肿瘤组及两CpG治疗组小鼠较正常组小鼠体重增长明显,终末期体重明显下降;肿瘤组小鼠瘤结节较同期两CpG治疗组小鼠大,且增长速度快;肿瘤组小鼠肝脏、脾脏、肿瘤组织中均可见广泛瘤细胞浸润,CpG治疗组肝脏、脾脏中瘤细胞浸润明显减少,脾脏白髓区明显较对照组扩大,小鼠免疫功能增强,减少了肿瘤细胞的器官浸润;两实验组小鼠注射CpG部位均未见红肿、硬结、坏死等不良反应.结论:CpG 1826、CpG Seq14直接用于急性粒-单核细胞白血病荷瘤小鼠模型的免疫治疗,均可增强小鼠抗肿瘤作用,延长生存时间,且无明显毒副作用.

目的 研究整合素CD11b激动剂白细胞黏附素1(LA1)对小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)中Toll样受体7(TLR7)和TLR9通路活化的影响,并探索其调控机制.方法 成功诱导BMDC,用CCK-8法和异硫氰酸荧光素标记的膜联素V/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)双染法筛选出对BMDC活性和凋亡都无影响的LA1浓度.LA1预处理BMDC 2 h后,用TLR7激动剂R837和TLR9激动剂CPG1826刺激BMDC,收集细胞用流式细胞术检测BMDC表面标志CD40、CD86和主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)的表达;收集细胞培养上清,用ELISA检测白细胞介素6(IL-)、IL-12p40和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;用Western blot法检测BMDC中核因子κB p65(NF-κB p65)的磷酸化水平.结果 LA1浓度低于20 μmol/L时对BMDC活力和凋亡无影响;LA1预处理显著抑制BMDC中R837和CpG1826诱导的CD40、CD86和MHC-Ⅱ的表达;LA1预处理显著抑制BMDC培养上清中R837和CPG1826诱导的IL-6、IL-12p40和TNF-α的含量;进一步研究发现,LA1预处理显著抑制BMDC中R837和CPG1826激活的NF-κB p65磷酸化水平.结论 CD11b激动剂LA1可显著抑制BMDC中TLR7和TLR9通路的活化,且通过NF-κB p65信号通路发挥作用.

目的 构建水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)糖蛋白H(glycoprotein H,gH)和糖蛋白L(glyco-p rotein L,gL)重组真核表达质粒,用质粒免疫小鼠,评价其免疫效果.方法 以提取的VZV基因组DNA为模板,PCR扩增gH胞外区基因(gH795)和gL全长基因,与pCI-neo载体连接,构建重组真核表达质粒pCI-neo-VZV-gH795-His和pCI-neo-VZV-gL-His;将质粒单独或与CpG1826佐剂共同免疫小鼠,免疫周期为0、3、5周,采血周期为3、5、7周,检测血清抗体效价、中和效价和膜免疫荧光抗体(fluorescent antibody to membrane antigen,FAMA)效价.结果 重组真核表达质粒pCI-neo-VZV-gH795-His和pCI-neo-VZV-gL-His经双酶切(Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ)和测序证明构建正确.单质粒免疫小鼠,血清抗体效价较低,双质粒免疫小鼠,血清抗体效价微弱升高,双质粒与佐剂共同免疫小鼠,血清抗体效价达1 ∶ 6 000以上,CpG1826对于抗体产生具有较明显的促进作用.仅双质粒与佐剂共免疫组小鼠血清显示出中和活性,免疫后7周,血清中和效价达1∶ 62.双质粒与佐剂共免疫组免疫后7周小鼠血清FAMA效价为1∶8～1∶16,其余各组均为阴性.结论 gH(或gHgL复合物)具有一定的免疫原性,本实验为其进一步的免疫原性研究奠定了基础.

目的 评价肿瘤疫苗在结肠癌模型小鼠体内的抑制效果.方法 用CpG的β-葡聚糖纳米颗粒(CpG β-glucan nanoparticles,CNP)于体外刺激小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs),同时设 PBS组、NP组(无CpG纳米颗粒)、Lysate组(MC38细胞裂解物)及CpG组(CpG1826),流式细胞术检测BMDCs表面标志分子的表达情况,ELISA法检测细胞培养上清中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和IL-12p40的含量.将50 mg/mL肿瘤裂解物(MC38细胞裂解物)与200mg/mL的CNP按1∶1的体积比混合,制备成肿瘤裂解物纳米疫苗.用该疫苗经皮下免疫C57BL/6J小鼠(Vaccine组),同时设PBS组、CNP组及Lysate组,每周1次,共免疫3次,末次免疫后1 h,经小鼠右下肢皮下接种MC38细胞,2×105个/只,每3 d测量1次肿瘤体积,并绘制肿瘤生长曲线;流式细胞术分析小鼠血液中CD3+CD4+T及CD3+CD8+T细胞比例;ELISA法检测小鼠血液和脾脏中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干扰素γ(interferon γ,IFNγ)的含量.结果 CNP在体外提高BMDCs表面标志物CD11c+CD80+、CD11c+CD86+、CD11c+MHC-Ⅱ+的表达及IL-6和IL-12p40的分泌水平明显高于其他4组(t=4.3～46.2,P均＜0.05).与其他3组比较,Vaccine组小鼠肿瘤体积明显减小(t=2.6～3.4,P均＜0.05);CD3+CD8+T及CD3+CD8+T细胞比例差异均无统计学意义(t=0.5～1.9,P均＞0.05);血液中IFNγ含量明显升高(t=3.8～4.6,P均＜0.05),TNF-α含量差异无统计学意义(t=0.4～2.0,P均＞0.05);脾脏中IFNγ及TNF-α含量均明显升高(t=6.3～13.0,P均＜0.001).结论 制备的肿瘤裂解物纳米疫苗能提高小鼠体内免疫水平,有效抑制结肠癌生长.