1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是MEP萜类合成途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成过程中发挥重要的作用.以福鼎大白茶为实验材料,在课题组前期转录组数据的基础上,运用RT-PCR技术克隆了茶树CsDXS1基因的完整开放阅读框(ORF).该ORF长度为2154 bp,编码717个氨基酸.生物信息学分析结果表明,茶树CsDXS1蛋白与其他植物的同源蛋白相似性高达85％-90％,属于DXS基因家族的I类基因,该蛋白是不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,有15个可信度高的磷酸化位点,具有典型的转酮醇酶亚家族功能域.利用实时荧光定量PCR对CsDXS1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,CsDXS1基因的表达水平在第三叶中最高,嫩叶中的表达量显著高于茎和老叶,表达水平从高到低依次为第三叶>第四叶>第二叶>第一叶>嫩茎>老茎>老叶.在不同激素处理中,CsDXS1的表达量受到不同程度的诱导,且表达量峰值的出现时间存在差异.CsDXS1在IAA和ABA激素处理下的表达量峰值最高(4 h),均为对照的1.5倍,在MeJA处理下表达量峰值最低(24 h),仅为对照的1.1倍.

以东方百合‘演员’花瓣为试验材料,采用RACE技术,克隆得到百合1脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因DXS的cDNA全长,命名为LeDXS(GenBank登录号为MF576067).序列分析表明,LeDXS基因cDNA序列全长2 471 bp,其中开放阅读框包含2 142 bp,编码713个氨基酸,相对分子量大小约为76.3 kD,等电点为6.65,化学式为C3370H5374N942O1016S32.系统进化分析结果显示,LeDXS与猕猴桃和万寿菊DXS聚为一类,属于Ⅰ型DXS,是功能较保守的一类.实时荧光定量PCR结果分析表明,LeDXS基因在不同品种百合花瓣中均有表达,且浓香型百合DXS基因表达量比淡香型和无香型百合高.该研究结果为百合DXS生物学功能研究奠定了基础,同时也为百合花香育种提供了理论依据.

萜类物质是自然界中广泛存在的一类天然化合物,对植物、动物和人类都有重要价值.1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)对萜类物质合成调控起关键作用,是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个酶,也是该途径的一个限速酶,亚细胞定位于类囊体中,具有质体转运肽序列和3个功能结构域:TPP结合结构域、转酮醇酶结构域和嘧啶结合结构域,可用高效液相色谱法测定其活性.目前已从178种植物中克隆分离到DXS基因,按蛋白同源性可分为3类:DXS1、DXS2和DXS3.DXS基因表达具有组织特异性、昼夜节律性,与花朵、果实发育程度和品种有关.转外源或内源DXS基因的植株过表达或抑制表达都会引起植物光合色素(如叶绿素和类胡萝卜素)、内源激素(如脱落酸和赤霉素)和单萜等萜类物质含量的改变.重点综述了DXS蛋白的特性、基因的类型、基因表达、调控和遗传转化方面的研究进展,以期为植物育种和代谢调节提供理论和实践参考.

以'西伯利亚'百合(Lilium'Siberia')花蕾期、半开期、盛开期、衰败期的花瓣为材料,利用RNA-seq技术对其转录组进行高通量测序,分析单萜合成途径中差异表达的基因并阐明其分子机制.结果显示,'西伯利亚'百合通过转录组测序分析共得到56.28 Gb clean base,223.40 Mb clean reads和124233个unigene,其中35749个基因得到注释.萜骨架合成途径中的基因表达水平在不同花期表现出显著差异.其中,甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸合成酶(HDS)、4-羟基-3-甲丁-2烯基二磷酸还原酶(HDR)、牻牛儿基二磷酸合成酶(GPS)基因的表达水平随花期变化呈先升高后降低的趋势.罗勒烯合成酶(OCS)基因表现出相似变化规律,在盛开期表达量最高.甲羟戊酸(MVA)途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因表达同样出现先升高后降低的趋势.单萜合成下游的分支途径中,茄尼基二磷酸合成酶(SDS)、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDR)基因的表达则出现相反的趋势,在盛开期的表达量最低.研究结果表明MEP途径中的关键基因可随花期变化规律性的表达,以调控单萜的生物合成,在盛开期有较高释放量,且盛开期MVA途径的活化以及泛醌和萜醌代谢支路基因的低表达也促进了单萜的生物合成.

将抗生素抗性基因作为标记筛选无痕基因敲除菌株比较费时,因而建立筛选无痕基因敲除菌株的简便方法.通过敲除茄红素生物合成途径中第一个反应的酶编码基因dxs(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因),获得白色地中海拟无枝酸菌突变菌株,以此菌株为受体菌,对S-丙二酰转移酶基因(mtf)进行无痕敲除.针对菌落本身携带颜色的地中海拟无枝酸菌(橘红色),利用茄红素合成酶基因dxs无痕敲除获得了白色菌株,在此基础上进行mtf的无痕敲除.以茄红素生物合成途径中任意一个反应的酶编码基因作为标记,很容易筛选得到无痕基因敲除的突变菌株.

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase, DXS) 是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸 (MEP) 途径的第一个关键酶.该研究根据川西獐牙菜Swertia mussotii转录组数据, 克隆获得其DXS2基因 (Gen Bank注册号MH535905) , 命名为Sm DXS2.生物信息学分析表明Sm DXS2基因无内含子, 其开放阅读框全长2 145 bp, 编码714个氨基酸, 分别属于20种氨基酸, 其中丙氨酸、甘氨酸和色氨酸含量最高;相对分子质量为76. 91 k Da, 理论等电点为6. 50, 属亲水性蛋白;二级结构中α-螺旋占36. 83％, 延伸链占9. 38％, loop占53. 78％;序列内部无信号肽, 没有跨膜区, 为非分泌型蛋白;序列中含有TPP结合位点、嘧啶结合结构域和C端的转酮酶结构域;系统发育分析结果显示Sm DXS2与滇龙胆DXS2共聚于一个分支.Sm DXS2基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为94 k Da, 与预测蛋白大小一致.该研究为进一步探讨该基因的功能和利用基因工程手段提高川西獐牙菜中环烯醚萜类化合物产量提供了理论依据.

目的 选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测.方法 以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulin alpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因.利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因.选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析.结果 内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性.在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根＜茎＜叶,DXR的相对表达量为茎＜根＜叶.在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高.结论 筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性.

本研究通过克隆香樟植物的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,进行生物信息学分析,为香樟DXS基因的功能及其表达调控提供基础.根据香樟转录组数据中注释为DXS的核苷酸拼接序列,设计特异性引物,进行香樟DXS基因的克隆,应用荧光定量PCR方法分析DXS基因在香樟根、茎和叶中的表达量.克隆获得香樟DXS基因,其cDNA序列长度为2 333 bp,开放读码阅读框(ORE)为2 187 bp,编码728个氨基酸,含有转酮醇酶等3个保守结构域.香樟DXS蛋白定位于叶绿体,是一个不含信号肽、无跨膜结构域的亲水性稳定蛋白,且蛋白二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲.通过氨基酸序列同源性分析发现,香樟DXS氨基酸序列与黄兰和鱼腥草的DXS氨基酸序列相似性较高,均为85％.分子进化树结果表明,香樟DXS蛋白与黄兰DXS蛋白亲缘关系较近.组织特异性表达分析结果显示,DXS在香樟叶与茎中的表达量高于根.成功克隆获得香樟DXS基因,研究结果为进一步探讨香樟DXS基因在萜类物质生物合成途径中的作用提供理论依据.

目的 克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析.方法 根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析.结果 荆芥StDXS基因全长2177bp,包含一个长度为2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸,其理论相对分子质量为77 240,等电点为6.32,定位于叶绿体,不存在跨膜区及信号肽,为非分泌蛋白.同源系统进化树分析表明,该序列与同科植物鼠尾草的DXS基因进化关系较近,均属于DXS1亚家族.密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以A/T结尾的密码子,具有28个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主.结论 成功克隆荆芥StDXS基因并进行生物信息学分析,为从分子水平调控荆芥的生长发育和改善药材产量和品质提供理论基础.

萜烯类化合物是一类高度多样化的天然产物,具有抗肿瘤、抗氧化及免疫调节等生理活性,因此被广泛应用于医药健康、食品、化妆品领域.然而,直接从自然资源中获取萜烯类化合物效率低、成本高,且往往对生态环境产生不利影响,不能实现绿色可持续生产.微生物合成萜烯类化合物近年来备受关注,研究人员从合成途径的构建与调控、关键酶的理性及半理性改造、发酵工艺优化等多个方面进行了探究,取得了丰硕的成果.其中,合成途径中关键酶的催化效率是影响微生物生产萜烯类化合物的重要因素.针对关键酶的研究对于提高微生物合成萜烯类化合物的能力,推动该类天然产物微生物生产的大规模应用具有重要意义.对萜烯类化合物合成途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊二烯基二磷酸合成酶(IDS)和萜烯合酶(TPS)4种关键酶的研究进行了综述,并总结讨论了如何通过代谢工程和蛋白质工程手段以及合成生物学技术调节关键酶的催化活性,提高微生物合成萜烯类化合物的效率,对未来利用微生物合成萜烯类化合物的发展进行了展望.