[目的]探究1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在紫丁香单萜类物质合成中的作用,为紫丁香花香分子育种提供有效的基因资源和理论基础.[方法]以紫丁香花瓣为材料,克隆了 SoDXR基因,并对其进行生物信息学和亚细胞定位分析、不同花发育时期和器官组织中的qRT-PCR表达分析以及探究其在金鱼草花瓣中异源瞬时过表达后的功能.[结果]SoDXR基因全长为1 425 bp,编码474个氨基酸,编码的蛋白具有保守的DXP_reductoisom结构域,与桂花和油橄榄的相似性高达95％.亚细胞定位显示该蛋白主要定位于质体,与软件预测结果一致.伴随着开花,SoDXR表达水平呈先升高后降低的趋势,在初开期最高,其在各个器官组织中均有表达,花瓣中表达量最高,茎中表达量最低.瞬时过表达表明,SoDXR基因的表达水平显著高于对照,促进了主要单萜成分罗勒烯和月桂烯的释放,释放量分别增加了 15.03倍和4.83倍.[结论]SoDXR基因正调控紫丁香单萜类物质的合成,表明DXR基因在花香次级代谢物合成中起到重要作用.

以'西伯利亚'百合(Lilium'Siberia')花蕾期、半开期、盛开期、衰败期的花瓣为材料,利用RNA-seq技术对其转录组进行高通量测序,分析单萜合成途径中差异表达的基因并阐明其分子机制.结果显示,'西伯利亚'百合通过转录组测序分析共得到56.28 Gb clean base,223.40 Mb clean reads和124233个unigene,其中35749个基因得到注释.萜骨架合成途径中的基因表达水平在不同花期表现出显著差异.其中,甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸合成酶(HDS)、4-羟基-3-甲丁-2烯基二磷酸还原酶(HDR)、牻牛儿基二磷酸合成酶(GPS)基因的表达水平随花期变化呈先升高后降低的趋势.罗勒烯合成酶(OCS)基因表现出相似变化规律,在盛开期表达量最高.甲羟戊酸(MVA)途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因表达同样出现先升高后降低的趋势.单萜合成下游的分支途径中,茄尼基二磷酸合成酶(SDS)、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDR)基因的表达则出现相反的趋势,在盛开期的表达量最低.研究结果表明MEP途径中的关键基因可随花期变化规律性的表达,以调控单萜的生物合成,在盛开期有较高释放量,且盛开期MVA途径的活化以及泛醌和萜醌代谢支路基因的低表达也促进了单萜的生物合成.

目的:克隆东北雷公藤萜类物质生物合成关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因全长,并对其进行生物信息学分析.方法:根据东北雷公藤转录组数据,设计特异性引物,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术克隆东北雷公藤DXR、HMGR基因编码区的全长序列,并进行一系列生物信息学分析.结果:成功克隆东北雷公藤DXR、HMGR基因各1条,分别命名为TrDXR和TrHMGR,两者分别长1410、1770bp,编码469个和589个氨基酸.TrDXR为亲水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,无跨膜结构,转运肽定位于叶绿体,含有2个结合功能域和2个活性位点基序;TrHMGR为疏水性蛋白,亚细胞定位在内质网,有跨膜结构,无转运肽,含有4个结合功能域.TrDXR和TrHMGR与不同物种同源序列的相似性高,保守性强.结论:克隆获得TrDXR、TrHMGR基因cDNA全长,并对其生物功能进行了初步预测,为基因功能鉴定及东北雷公藤萜类物质分子形成机制研究奠定基础.

从巴戟天中克隆MEP途径中的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶基因MoDXR及其启动子序列,并进行生物信息学分析、启动予区顺式作用元件分析,以及进行原核表达分析.根据巴戟天转录组中DXR基因原始序列和NCBI-ORFfinder分析,设计特异性引物,并进行RT-PCR扩增和生物信息学分析;采用染色体步移克隆MoDXR基因的5'端启动子序列;通过亚细胞定位分析MoDXR基因在细胞中的位置;构建原核表达载体pET-28a-MoDXR,导入BL21(DE3)表达感受态细胞后,在IPTG诱导下表达.从巴戟天中克隆的MoDXR基因,其cDNA全长2 015 bp,预测的阅读框大小为1 425 bp,编码474个氨基酸,分子质量为51.27 kDa;BlastP序列比对分析表明MoDXR基因与其他植物的DXR基因具有高度同源性,如:咖啡树DXR(CaDXR)、萝芙木DXR (RvDXR);系统进化发育树分析显示,巴戟天MoDXR蛋白与小粒咖啡和栀子的DXR蛋白聚为一类,其亲缘关系最近;由亚细胞定位可知MoDXR基因所编码的蛋白定位于叶绿体上;MoDXR基因5'端启动子序列长度为1 493 bp,包含了与光响应、胁迫响应和激素响应有关的多种调控元件;SDS-PAGE结果表明pET-28a-MoDXR重组蛋白的大小与预期相符,但是以不容性的包涵体的形式表达.成功克隆了MoDXR基因及其启动子序列并对其进行了生物信息学分析和启动子区顺式作用元件分析;后期需要优化MoDXR原核表达体系,为进一步纯化MoDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础.

[目的]萜类化合物广泛分布在生物界,是重要的生命物质.目前发现有两条萜类化合物的生物合成途径,即甲羟戊酸(MVA)途径和2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径.MEP代谢途径中的关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(DXR,EC1.1.1.267)催化1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸生成MEP.枯草芽胞杆菌中dxr基因编码DXR酶,而在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)中有2个基因(dxr1 和dxr2)编码DXR酶.通过分析Bt HD73菌株的dxr1基因的转录活性和dxr1突变体表型,明确dxr1 基因的转录调控机制和功能.[方法]通过5'RACE分析dxr1的转录起始位点;β-半乳糖苷酶活性测定分析dxr1基因启动子(Pdxr1)的转录活性;采用同源重组技术分别敲除Bt HD73菌株的dxr1和dxr2基因;利用总蛋白定量确定Cry1Ac蛋白产量;利用DXR检测试剂盒检测Bt菌株的DXR活性.[结果]dxr1基因的转录起始位点位于起始密码子上游39 bp处的G碱基;与出发菌株HD73相比,Pdxr1在sigH突变体中的转录活性明显降低;dxr1或dxr2基因的缺失对菌体生长、芽胞形成率和Cry1Ac蛋白产量无显著影响,但使DXR活性下降.[结论]Bt中dxr1基因的转录受SigH控制,dxr1基因的缺失影响DXR的活性.

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)是MEP途径的关键酶之一,参与植物萜类与蒽醌等化合物的生物合成.萜类与蒽醌类化合物在较多豆科植物中存在,研究豆科植物dxr基因的密码子偏好性,对以dxr基因为靶点的分子调控具有重要指导意义.运用CodonW、CHIPS、CUSP和CAI等程序分析豆科植物drx基因密码子的偏好性,并用豆科植物决明的dxr基因对分析结果的可靠性进行验证.研究成果显示,以A或U结尾的密码子在dxr基因的密码子中表现出较强的偏好性.相比于烟草,拟南芥更适合作为研究dxr基因功能的模式植物.比较豆科植物dxr基因与大肠杆菌及酵母基因组密码子偏好性,发现酵母的差异明显低于大肠杆菌,表明对于豆科植物dxr基因来说,酵母表达系统比大肠杆菌表达系统更好.但是要使豆科植物dxr基因在酵母表达系统中具有高表达效率,仍需对其密码子进行优化.

目的 选择合适的内参基因,用于巴戟天不同组织和不同处理的叶中目标基因表达量的分析检测.方法 以巴戟天不同组织和不同处理的叶为材料,根据巴戟天转录组数据,选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)、微管蛋白α(tubulin alpha,TUA)和肌动蛋白(Actin)基因等10个内参基因作为候选基因.利用实时荧光定量技术,并结合geNorm、NormFinder和BestKeeper等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出巴戟天不同组织和不同处理叶中表达稳定的内参基因.选择合适的内参基因对巴戟天的1-脱氧木酮糖-5磷酸合成酶(DXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因在不同组织和不同处理的叶中相对表达量进行分析.结果 内参基因GAPDH和泛素(UBQ)在巴戟天不同组织中表达最稳定,GAPDH+UBQ的双内参组合能够更加准确地分析目的基因在巴戟天不同组织的相对表达量,而在不同处理的叶中GAPDH和Actin表达稳定性最好,选择GAPDH+Actin的双内参组合可以确保目的基因相对分析表达结果的可靠性.在巴戟天不同组织中,DXS目的基因的相对表达量为根＜茎＜叶,DXR的相对表达量为茎＜根＜叶.在巴戟天不同处理的叶中,DXS和DXR基因的相对表达量相对于未处理的叶(CK)都有所提高.结论 筛选得到的稳定内参基因为后续巴戟天相关基因表达研究奠定基础,使用2个稳定内参的组合对目的基因进行均一化处理有利于提高目的基因表达分析的准确性.

目的:克隆夏枯草1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因并分析该基因的表达特性.方法:采用逆转录PCR技术克隆夏枯草DXR基因全长,并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR法分析PvDXR在不同组织及不同外源性物质诱导下的表达特性.结果:PvDXR基因编码全长为1 422 bp,编码473个氨基酸组成的蛋白质序列,理论分子量为51 351.49D,为不稳定蛋白并具疏水性,含有2个跨膜螺旋区.PvDXR基因在叶中表达最高,茎中次之,果穗中表达量最少.7种外源性物质处理24 h后该基因在果穗中的表达量均有所降低,且ETH、GA3及CaCl2处理后基因的表达量降低最多.结论:获得PvDXR基因的全长cDNA,并揭示了其在不同组织及外源性物质诱导下的表达差异,为后续研究PvDXR基因在夏枯草三萜类成分合成途径中的功能奠定基础.

甾体皂苷是药用植物中普遍存在的一类功效物质,由糖基和甾体皂苷元缩合而成,甾体皂苷的生物合成途径主要包括细胞质甲羟戊酸(MVA)途径和质体2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)两条途径,并以MVA途径为主.在生物合成途径中涉及一系列关键酶,包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR),1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS),1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR),法尼基焦磷酸合酶(FPS),鲨烯合酶(SS),鲨烯环氧酶(SE),环阿屯醇合酶(CAS),细胞色素P450酶(CYP450),糖基转移酶(SGTase)等.在综合前人研究的基础上,该文对甾体皂苷生物合成途径路线图进行了补充和细化,而对近5年来有关药用植物甾体皂苷生物合成关键酶(基因)生物学信息研究报道整理发现,药用植物中HMGR,SS,CYP450,UGT基因研究相对较多,而对FPS,SE,CAS的报道则较少.整体来看,目前对甾体皂苷生物合成途径研究尚处于初级阶段,对于关键酶功能研究缺乏强有力的直接证据.可为甾体皂苷的后续研究提供参考和理论支撑.

本研究根据决明三代转录组测序获得的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(CoDXS)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(CoDXR)基因的全长序列设计特异性引物,PCR扩增获得CoDXS、CoDXR基因的OFR,构建原核表达载体pTrc-CoDXS、pTrc-CoDXR在含有质粒PAC-BETA的TOP10重组菌中进行表达,通过TOP10的菌斑颜色变化来验证CoDXS和CoDXR基因的功能.利用实时荧光定量PCR来检测CoDXS、CoDXR基因在决明不同组织中以及六种胁迫条件下的表达情况.研究结果表明CoDXS、CoDXR基因的OFR分别为2 127、1 416 bp,编码的氨基酸数目分别为708、471,功能鉴定结果显示含有CoDXS、CoDXR基因编码区的TOP10菌斑呈现出深橘黄色;CoDXS基因的表达趋势为:花＞茎＞种子＞叶＞根,CoDXR基因的表达趋势为:叶＞花＞茎＞根＞种子.对CoDXR和CoDXS基因在不同的胁迫条件下的相对表达量检测分析发现,在盐胁迫条件下:CoDXS基因的表达量整体呈现出下降趋势,CoDXR基因的表达量波动范围较小;在ABA胁迫条件下:CoDXS基因的表达量呈现出先下降上升趋势,CoDXR基因的表达量呈现出上升趋势;在MeJA胁迫条件下:CoDXR和CoDXS基因的表达量均呈现出先下降后上升的趋势;在PEG6000胁迫条件下:对CoDXS基因表达量的影响较小,CoDXR基因的表达量呈现出上升趋势;在高温胁迫条件:CoDXS基因呈现出下降趋势,对CoDXR基因的表达影响较小;低温胁迫条件下:CoDXR和CoDXS基因的表达均呈现出下降趋势.