9α-羟基雄甾-4-烯-3,17二酮(9α-OH-AD)是重要的甾体药物中间体,多用于生产糖皮质激素类药物.通过微生物法转化植物甾醇生成9α-OH-AD,将为工业化生产提供极大便利.从榨油厂油菜花田等多处土壤中筛选出1株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的菌株,根据16S rDNA序列比对并结合菌株的形态特征、生理生化特征分析,鉴定其为分枝杆菌属,并将其命名为Mycobacterium sp.LY-1.该菌在往复式摇床中培养,当培养条件为温度30℃、转速120 r/min、转化时间7d、底物添加浓度为5 g/L时,9α-OH-AD产物得率达到16.2％.为解决底物植物甾醇在水中溶解性较差的问题,考察了助溶剂(吐温80、β-环糊精)对植物甾醇转化产甾药中间体9α-OH-AD效率的影响.经过筛选,最终确定最适助溶剂为0.1％的吐温80.在此条件下,当底物投料浓度为15 g/L时,9α-OH-AD的浓度达到3.9 g/L,产物摩尔得率提高至35.1％.本研究表明菌株LY-1转化效率好,可为后续的代谢工程改造提供便利并为后期用于工业化生产奠定基础.

研究应用于甾体9α-羟基化的高效催化剂和催化体系是实现甾体药物9α位羟基高效合成的关键.本文中,笔者对来源于分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)SQ1的3-甾酮-9α-羟基化酶基因(rekshA,mtkshA)进行优化,并对2个基因的催化活性进行检测.通过构建工程表达菌株,以雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为底物,对制备9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)的催化反应进行了探索.结果表明:基因序列优化显著提升了ReKshA和MtKshA蛋白的可溶性表达,其中ReKshA具有较好的雄甾-4-烯-3,17-二酮9α位羟基化活性.用TB培养基培养ReKshA的工程表达菌株BL21(DE3)-pET28a-rekshA-yh,在30℃、500 μmol/L底物浓度、0.8％(体积分数)乙醇为助溶剂、0.1 mmol/L IPTG诱导浓度、底物与诱导剂同时加入到工程菌液中的条件下,9α-OH-AD得率达到97.09％.

9α-羟基雄甾-4-烯-3, 17-二酮 (9α-OH-AD) 是一种重要的甾体药物中间体, 可用于糖皮质激素类药物的生产.为了提高目的产物的产量, 以分枝杆菌 (Mycobacterium sp.) LY-1作为出发菌株, 研究不同碳源、氮源、磷酸盐和金属离子等培养基组分对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响, 结合正交试验优化, 确定最适培养基组分为玉米浆30 g/L、KNO3 4.0 g/L、NaH2PO4 1.2 g/L、FeSO4 0.075 g/L及CaCl2 0.10 g/L.在此条件下, 当植物甾醇投料质量浓度为15 g/L时, 产物得率达到43.9％～44.9％.通过单因素实验优化培养条件, 得到最适培养条件为pH 8.0、接种量2％、温度30℃时, 9α-OH-AD的得率可达46.2％～47.0％, 比优化前提高了22.1％, 产量达到5.21 g/L, 具有潜在的工业应用价值.

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可以用来制备β-甾酮,地塞米松和其他类固醇化合物.3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)是由两个亚基即末端氧化亚基(KshA)和铁氧还蛋白还原亚基(KshB)构成的.在本研究中,人工合成了来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.Strain VKMAc-1817D的kshA和kshB基因,通过优化表达载体促进了KshA和KshB在E.coli BL21 (DE3)中的可溶性表达,并探究了催化体系中KSH还原亚基和氧化亚基的最适添加比例.此外,KSH转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(A))为9-OH-AD的过程中需要辅酶NADH.本研究构建了羟基化反应与利用葡萄糖脱氢酶(GDH)的NADH辅酶再生反应的偶联体系.为了进一步提高转化效率,本研究进行了转化条件的优化,并采取了分批补料的策略,最终9-OH-AD产量为4.78 g/L,转化率为96.7％.此种酶介导的转化生产9-OH-AD的方法为甾体药物生产提供了一种环境友好和经济实用型的新策略.

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-羟基-雄烯二酮,9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,主要用于糖皮质激素类和性激素类药物的生产,可由微生物转化法降解植物甾醇而得.植物甾醇在水中的溶解度极低,生物可利用度不高,严重制约了微生物对植物甾醇底物的利用效率.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的摩尔得率,以前期诱变筛选的Mycobacterium sp.LY-1作为出发菌株,考察不同HLB值的表面活性剂对9α-OH-AD摩尔得率的影响,筛选得到最适表面活性剂,并建立高效的油水转化体系(油水体系的HLB=7.3).结果表明,HLB值为15的表面活性剂Tween-80有利于提高9α-OH-AD的摩尔得率,当添加4.0 g/L Tween-80时,9α-OH-AD的摩尔得率达到38.5％.在该工作基础上,发现添加促溶剂100.0 g/L的大豆油对分枝杆菌转化植物甾醇生成9α-OH-AD具有促进作用.同时,添加4.0 g/L Tween-80和100.0 g/L大豆油时,当植物甾醇质量浓度为30 g/L时,9α-OH-AD摩尔得率为36.9％,9α-OH-AD质量浓度达到8.17 g/L,较对照提高了324.1％.本研究表明建立的油水转化工艺体系在一定程度上增加了底物质量浓度,提高了菌体的转化能力,结果可为甾醇生物转化体系的研究提供重要的参考信息.

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,分枝杆菌转化植物甾醇的过程中,9α-OH-AD的分解是导致其产率降低的一个关键因素,之前的研究已表明,3-甾酮-△1-脱氢酶(3-ketosteroid-△1-dehydrogenase,KstD)在9α-OH-AD的分解过程中起着重要的作用.耻垢分枝杆菌mc2155(Mycobacterium smegmatis mc2155)菌株基因组中存在6个编码3-甾酮-△1-脱氢酶基因,通过对这6个脱氢酶基因分别进行外源表达和活性测定,发现只有KstD1、KstD2和KstD3具有脱氢活力;使用CRISPR-Cas12a辅助重组技术成功构建了失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株,结果显示单独失活基因kstD1能够产生9α-OH-AD,但随着转化时间的延长,9α-OH-AD会降解,无法积累,同时失活kstD1、kstD2和kstD3的菌株以5 g/L植物甾醇为底物时,转化14 d内9α-OH-AD能够稳定存在,产物浓度达到2.86 g/L.可见,耻垢分枝杆菌mc2155中kstD1基因对9α-OH-AD积累起关键作用,随着转化的进行和产物的积累,kstD2和kstD3的作用逐渐显现,同时失活3个3-甾酮-△1-脱氢酶有效提高了菌种生产9α-OH-AD的稳定性和产率,本研究结果可为构建9α-OH-AD生产菌种及产业化应用奠定基础.

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种卤代皮质类激素的重要前体,具有重要的商用价值.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的产量,在本实验室前期利用非离子表面活性剂壬基酚乙氧乙烯醚(TX-40)替代大豆油进行Mycobacterium sp.LY-1转化植物甾醇的基础上,通过考察16种助溶剂与TX-40复配对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响,确定最适助溶剂为司盘-20.通过正交优化实验确定司盘-20的最优添加浓度为0.1％.进一步考察不同浓度细胞膜结构抑制剂甘氨酸、鱼精蛋白、异烟肼对菌株LY-1转化植物甾醇的影响,结果显示在以上转化体系中添加1.0 μg/mL的鱼精蛋白时,9α-OH-AD的摩尔得率最高,达到46.4％.最终确定菌株LY-1降解植物甾醇的两相转化体系为TX-40 0.7％,司盘-20 0.1％,鱼精蛋白1.0 μg/mL.该体系于植物甾醇的投料浓度提高至35 g/L时,目的产物9α-OH-AD的摩尔得率仍能稳定在32.5％以上.本研究成功构建了Mycobacterium sp.LY-1高效转化植物甾醇的两相体系,结果可为其工业化应用奠定良好基础.

甾体激素药物是仅次于抗生素的第二大类药物,当前甾体工业的初始原料已经由从黄姜等植物中提取的薯蓣皂素转向植物甾醇.作为食用油工业的副产物,植物甾醇来源广泛,价格低廉,经微生物转化后可生成雄烯二酮(androstenedione,AD)、雄二烯二酮(androstadiendione,ADD)、9α-羟基-雄烯二酮(9α-hydroxy-androstenedione,9α-OH-AD)等一系列化合物,这些关键中间体可用于甾体药物合成.甾体代谢途径长、副产物多、调控复杂,传统的微生物筛选、诱变育种方法和油水两相转化体系已经不适于当前的工业生产需求.文中以笔者团队与浙江仙居君业药业有限公司联合开发的新一代甾体药物关键中间体的转化菌株构建和智能化生产为例,综述甾体药物中间体菌种改造和转化工艺开发及其在产业化应用中的进展.未来,随着合成生物学技术的发展,有望开发出更适于甾体药物合成的新一代中间体;乃至以葡萄糖等为原料,使用微生物直接合成甾体原料药.这些生物技术(biotechnology,BT)创建的新一代菌株在基于信息化、智能化技术(intelligent technology,IT)建设的现代工厂中的应用,将会形成更高效、更绿色的生产方式,并产生显著的社会效益和经济价值.