目的 观察肺结核患者血清微小RNA-223(miR-223)水平变化,以及转染miR-223模拟物的巨噬细胞结核分枝杆菌(MTB)H37Rv清除能力、凋亡、炎症反应变化,并分析miR-223与NLRP3靶向关系.方法 选取37例份活动性肺结核患者血清标本(肺结核组)和同期40例健康体检者血清标本(健康组),采用RT-PCR法检测两组血清标本中miR-223.体外培养人单核细胞株THP-1,经佛波脂刺激24 h后分化为巨噬细胞,将巨噬细胞随机分为健康组、MTB组、MTB+mimics-NC组、MTB+miR-223 mimics组,健康组细胞常规培养,MTB组、MTB+mimics-NC组、MTB+miR-223 mimics组均用MTB标准株H37Rv感染巨噬细胞,感染后MTB+mimics-NC组和MTB+miR-223 mimics组应用脂质体转染法分别将mimics-NC、miR-223 mimics转染至细胞中,采用RT-PCR法检测各组细胞miR-223及NLRP3、TNF-α、IFN-γ mRNA,流式细胞术测算各组细胞凋亡率,菌落形成单位(CFU)计数法检测各组H37Rv细菌负荷量.取对数生长期THP-1细胞,随机分为miR-223 mimics+NLRP3-WT组、mimics-NC+NLRP3-WT组、miR-223 mimics+NLRP3-MUT组、mimics-NC+NLRP3-MUT组,用Lipofectamine 2000按照试剂盒说明书操作分别将miR-223 mimics和NLRP3-WT、mimics-NC和NLRP3-WT、miR-223 mimics和NLRP3-MUT、mimics-NC和NLRP3-MUT共转染至各组细胞,转染后24 h检测各组细胞的相对荧光素酶活性,双荧光素酶报告基因实验验证miR-223与NLRP3是否存在靶向关系.结果 与健康组比较,肺结核组血清miR-223表达降低(P<0.05).与健康组比较,MTB组miR-223表达、细胞凋亡率降低,NLRP3、TNF-α、IFN-γ mRNA表达及H37Rv细菌负荷量升高(P均<0.05);与MTB+mimics-NC组比较,MTB+miR-223 mimics组miR-223表达、细胞凋亡率升高,NLRP3、TNF-α、IFN-γ mRNA表达及H37Rv细菌负荷量降低(P均<0.05).双荧光素酶报告基因实验显示,NLRP3是miR-223的靶向基因.结论 肺结核患者血清miR-223表达降低,转染miR-223模拟物能够促进巨噬细胞凋亡,增强MTB感染的巨噬细胞的除菌能力,减轻炎症反应,其机制可能与靶向调控NLRP3有关.

目的 探讨泌尿系结核(UTB)误诊原因,提高临床医师对该疾病的认识.方法 对2023 年2-7 月收治的UTB 5 例临床资料进行回顾性分析.结果 本组中临床表现尿频尿急4 例,血尿3 例,腰痛3 例,发热2 例;尿常规异常4 例,尿抗酸杆菌涂片阳性1 例,24h尿沉渣GeneXpert MTB/RIF阳性4 例,尿分枝杆菌培养阳性4 例,血结核感染T细胞斑点试验阳性5 例.影像学表现有肾积水、输尿管扩张及尿路钙化4 例,膀胱占位1 例,肾自截1 例.活动性肺结核3 例,陈旧性肺结核2 例.5 例延误诊治时间2～6 年.误诊为泌尿系感染合并肾结石2 例,泌尿系感染合并膀胱恶性肿瘤1 例,肾结石1 例,前列腺增生1 例;4 例确诊后予抗结核治疗,1 例未治疗,随访中2 例死亡.结论UTB由于临床表现缺乏特异性、早期诊断困难以及临床医师认识不足,容易误诊导致严重后果.对于复杂性尿路感染患者常规抗感染效果不佳,尤其是有胸部影像学异常时,需高度警惕UTB可能.

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17二酮(9α-OH-AD)是重要的甾体药物中间体,多用于生产糖皮质激素类药物.通过微生物法转化植物甾醇生成9α-OH-AD,将为工业化生产提供极大便利.从榨油厂油菜花田等多处土壤中筛选出1株高效转化植物甾醇为9α-OH-AD的菌株,根据16S rDNA序列比对并结合菌株的形态特征、生理生化特征分析,鉴定其为分枝杆菌属,并将其命名为Mycobacterium sp.LY-1.该菌在往复式摇床中培养,当培养条件为温度30℃、转速120 r/min、转化时间7d、底物添加浓度为5 g/L时,9α-OH-AD产物得率达到16.2％.为解决底物植物甾醇在水中溶解性较差的问题,考察了助溶剂(吐温80、β-环糊精)对植物甾醇转化产甾药中间体9α-OH-AD效率的影响.经过筛选,最终确定最适助溶剂为0.1％的吐温80.在此条件下,当底物投料浓度为15 g/L时,9α-OH-AD的浓度达到3.9 g/L,产物摩尔得率提高至35.1％.本研究表明菌株LY-1转化效率好,可为后续的代谢工程改造提供便利并为后期用于工业化生产奠定基础.

目的:探讨富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用机制.方法:用结核分枝杆菌疫苗株卡介苗(BCG)感染巨噬细胞RAW264.7,菌落形成单位(CFU)计数检测结核分枝杆菌生存率;酶联免疫吸附法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ)表达水平;qPCR和Western blot法分别检测相关mRNA和蛋白的表达.结果:BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中LRRK2的mRNA和蛋白表达均显著上调,并刺激RAW264.7细胞释放大量细胞因子.此外,沉默LRRK2明显抑制BCG感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率;同时,沉默LRRK2降低BCG刺激诱导分泌的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ.更为重要的是,LRRK2可能通过正调控NF-κB通路调节BCG诱导的炎症应答进程.结论:LRRK2/NF-κB信号正调控BCG刺激诱导的巨噬细胞炎症应答进程.本研究结果为结核病在基因水平上的诊断和治疗提供了实验依据.

目的 对艾滋病(AIDS)合并腹腔结核性脓肿进行结核分枝杆菌(MTB)培养及耐药检测,并分析AIDS患者细胞免疫功能状态与MTB培养阳性率及耐药率的关系,为制定抗痨治疗方案提供依据.方法 选取2010年1月至2016年12月成都市公共卫生临床医疗中心普通外科暨肿瘤外科收治的腹腔结核性脓肿患者262例,其中AIDS合并腹腔结核性脓肿(HIV+组)96例、未合并AIDS的腹腔结核性脓肿(HIV-组)166例.以开腹脓肿切开引流术、腹腔镜下脓肿切开引流术、超声引导下腹腔脓肿穿刺置管引流术三种方式采集腹腔结核性脓肿的脓液或/和脓腔壁组织送检.采用罗氏改良培养基BACTBC MGIT960及微孔板比例法进行MTB培养和耐药检测.以术前CD4+T淋巴细胞计数作为分层依据,将HIV+组分为HIV+Ⅰ组(<100 cells/μL)19例、HIV+Ⅱ组(100~200 cells/μL)46例、HIV+Ⅲ组(>200 cells/μL)31例,分析不同免疫功能状态下HIV/AIDS合并腹腔结核性脓肿的MTB培养阳性率及耐药情况.结果 262例腹腔结核性脓肿共培养MTB 94株(35.9%),其中耐药菌株34株(36.2%);HIV+Ⅱ组患者的MTB培养阳性率为45.8%,高于HIV-组的30.1%,差异有统计学意义(P<0.05);HIV+组患者的耐药率为38.6%,与HIV-组的34.0%比较,差异无统计学意义(P>0.05);HIV+组与HIV-组患者抗痨一线药物耐药情况分别为异烟肼28.1%/30.1%、利福平18.7%/16.9%、链霉素37.5%/34.6%、乙胺丁醇12.5%/15.3%;抗痨二线药物耐药情况分别为卷曲霉素31.2%/26.4%、氧氟沙星21.8%/25.2%、卡那霉素18.7%/15.9%、丙硫异烟胺6.2%/8.1%.HIV+Ⅰ组、HIV+Ⅱ组及HIV+Ⅲ组患者MTB培养阳性率分别为31.6%、58.7%与35.5%,耐药率分别为50.0%、40.7%、及27.3%,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 AIDS合并腹腔结核性脓肿的MTB培养阳性率高于HIV阴性腹腔结核性脓肿,但是两组之间MTB耐药率无明显差异;在AIDS合并腹腔结核性脓肿患者中,未发现CD4+T淋巴细胞计数与MTB培养阳性率及MTB耐药率存在统计学相关性.因此,AIDS合并腹腔结核性脓肿进行MTB培养及耐药检测有利于制定合理的个体化的抗痨方案,获得理想预后.

目的 用不同阻断剂下调调控抗凋亡蛋白Mcl-1表达信号通路, 探讨下调Mcl-1表达对结核杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞凋亡和炎症反应的影响.方法 制备结核分枝杆菌国际标准强H37Rv菌株菌悬液, 感染BALB/c小鼠, 再分别腹腔注射Mcl-1信号通路阻断剂AG490、PD98059、LY294002, 同时设立对应的对照组.应用ELISA筛选不同阻断剂处理小鼠的最佳剂量, 采用TUNEL试剂盒检测阻断剂应用后小鼠腹腔巨噬细胞凋亡率, 透射电镜观察阻断剂应用后宿主巨噬细胞的形态学变化, HE染色分析应用阻断剂后小鼠肝、肺、脾、肾脏器的病理损伤情况.结果 阻断剂处理H37Rv感染组小鼠巨噬细胞凋亡率与空白对照组均有不同程度的增高, 其中PD98059处理组显著高于其他处理组 (P<0.05);阻断剂PD98059处理组小鼠巨噬细胞感染H37Rv数量明显减少, 且出现核固缩和凋亡.H37Rv感染小鼠肝、肺、脾、肾脏器出现严重病理损伤, 而阻断剂应用后的病理损害程度明显减轻 (P<0.05) .结论 应用阻断剂下调Mcl-1的表达可促进结核杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞的凋亡, 减少巨噬细胞内潜伏H37Rv数量, 减轻结核感染对小鼠脏器的病理损伤.作用效果以MAPK信号通路阻断剂PD98059强于JAK/STAT和PI3K信号通路阻断剂AG490和PD98059.

目的 观察阻断髓样细胞白血病-1(Mcl-1)表达的信号通路对H37Ra感染小鼠的影响,从而探讨Mcl-1干预在此过程中的作用.方法 制备好结核分枝杆菌H37Ra的菌悬液后,将其感染BALB/c小鼠,再用Mcl-1信号通路阻断剂AG490、PD98059、LY294002分别腹腔注射结核感染的小鼠模型,并同时设立相应的对照组.应用倒置显微镜观察巨噬细胞形态、TUNEL技术检测阻断剂应用后巨噬细胞的凋亡率、细胞免疫化学分析Mcl-1的表达、HE染色观察小鼠脏器的病理损伤变化.结果 阻断剂处理后的H37Ra感染组凋亡率与空白对照组相比,均出现不同程度的升高,其中PD98059处理组凋亡率最高(P<0.05).阻断剂PD98059处理后,H37Ra在巨噬细胞内的菌落数量明显减少,小鼠肝、肺、脾、肾的病理损害程度明显减轻(P<0.05).结论 阻断Mcl-1表达的信号通路可以显著促进结核感染的小鼠巨噬细胞的凋亡,减少结核杆菌在宿主巨噬细胞内的存活,减轻结核感染对小鼠脏器的病理损伤.而MAPK信号通路是此过程中调控Mcl-1表达的主要通路,且PD98059为其特异性抑制剂.

9α-羟基雄甾-4-烯-3, 17-二酮 (9α-OH-AD) 是一种重要的甾体药物中间体, 可用于糖皮质激素类药物的生产.为了提高目的产物的产量, 以分枝杆菌 (Mycobacterium sp.) LY-1作为出发菌株, 研究不同碳源、氮源、磷酸盐和金属离子等培养基组分对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响, 结合正交试验优化, 确定最适培养基组分为玉米浆30 g/L、KNO3 4.0 g/L、NaH2PO4 1.2 g/L、FeSO4 0.075 g/L及CaCl2 0.10 g/L.在此条件下, 当植物甾醇投料质量浓度为15 g/L时, 产物得率达到43.9％～44.9％.通过单因素实验优化培养条件, 得到最适培养条件为pH 8.0、接种量2％、温度30℃时, 9α-OH-AD的得率可达46.2％～47.0％, 比优化前提高了22.1％, 产量达到5.21 g/L, 具有潜在的工业应用价值.

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-羟基-雄烯二酮,9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,主要用于糖皮质激素类和性激素类药物的生产,可由微生物转化法降解植物甾醇而得.植物甾醇在水中的溶解度极低,生物可利用度不高,严重制约了微生物对植物甾醇底物的利用效率.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的摩尔得率,以前期诱变筛选的Mycobacterium sp.LY-1作为出发菌株,考察不同HLB值的表面活性剂对9α-OH-AD摩尔得率的影响,筛选得到最适表面活性剂,并建立高效的油水转化体系(油水体系的HLB=7.3).结果表明,HLB值为15的表面活性剂Tween-80有利于提高9α-OH-AD的摩尔得率,当添加4.0 g/L Tween-80时,9α-OH-AD的摩尔得率达到38.5％.在该工作基础上,发现添加促溶剂100.0 g/L的大豆油对分枝杆菌转化植物甾醇生成9α-OH-AD具有促进作用.同时,添加4.0 g/L Tween-80和100.0 g/L大豆油时,当植物甾醇质量浓度为30 g/L时,9α-OH-AD摩尔得率为36.9％,9α-OH-AD质量浓度达到8.17 g/L,较对照提高了324.1％.本研究表明建立的油水转化工艺体系在一定程度上增加了底物质量浓度,提高了菌体的转化能力,结果可为甾醇生物转化体系的研究提供重要的参考信息.

[背景]分枝杆菌LY-1因能够将天然植物甾醇代谢转化为重要甾体药物中间体,目前已成为工业上的优势生产菌株.高效的CRISPR/Cas9基因编辑技术是工业菌株代谢工程改造进行产量性状提升的关键.然而由于Cas9蛋白的高表达毒性问题且分枝杆菌中已公开报道的可用表达元件较少,极大地限制了Cas9蛋白在该菌株中的适度表达.[目的]筛选内源性表达元件,利用合适的表达元件启动Cas9蛋白的表达,降低其对菌株的毒性.[方法]依据文献和前期研究获得的分枝杆菌基因转录组水平数据,并结合启动子在线预测网站BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html),筛选内源性表达元件.以增强型绿色荧光蛋白作为报告基因对表达元件的强度进行评估,并采用不同强度的表达元件启动Cas9蛋白的表达.[结果]获得了23个不同表达强度的表达元件,采用中等强度的表达元件及弱表达元件都降低了Cas9蛋白对分枝杆菌LY-1的毒性,实现了Cas9蛋白在该菌株中的适度表达.[结论]建立了分枝杆菌LY-1内源性表达元件库,为后续菌株中高效CRISPR/Cas9基因编辑技术的构建及关键酶基因调控奠定了良好的基础.