目的:探讨甘氨酸对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制。方法:采用实验研究方法。取30只7~8周龄雌雄各半Wistar大鼠，其中10只用于制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），将另20只造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清；从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为用相应血清处理的正常血清组、烧伤血清组，于处理1、3、6、9、12 h进行锥虫蓝染色检测细胞存活率；将细胞分为用烧伤血清处理6 h后常规培养30 min的单纯烧伤血清组和用烧伤血清处理6 h后加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min的0.4 mmol/L甘氨酸组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组、2.0 mmol/L甘氨酸组，即干预6.5 h，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组，分别同前干预6.5 h，采用高效液相色谱法检测腺苷一磷酸（AMP）和ATP含量并计算AMP/ATP比值，采用蛋白质印迹法检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（p-mTORC1）、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶（p-p70 S6K）、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1（p-4E-BP1）、磷酸化AMP活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表达。将细胞分为同前干预的正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组和用烧伤血清处理后加2种试剂培养的0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组，于处理1、3、6 h行相应培养30 min，即干预1.5、3.5、6.5 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）、金属硫蛋白（MT）和微管蛋白表达并观察干预6.5 h微管形态。各时间点样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:处理1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t值分别为4.96、16.83、35.51、34.33、27.88， P<0.05）。在烧伤血清组中，处理3、6、9、12 h细胞存活率均较处理1 h明显降低（ P<0.05），处理6、9、12 h细胞存活率均较处理3 h明显降低（ P<0.05），处理6 h细胞存活率与处理9 h相近（ P>0.05）但明显高于处理12 h（ P<0.05）；选择处理6 h作为后续烧伤血清干预时间。干预6.5 h，与单纯烧伤血清组比较，各甘氨酸组细胞存活率均明显升高（ P<0.05）。0.8 mmol/L甘氨酸组细胞存活率最高，选择0.8、1.2、1.6 mmol/L作为后续甘氨酸的干预浓度。干预6.5 h，单纯烧伤血清组细胞AMP/ATP比值较正常血清组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组明显升高（ P值均<0.05），1.6 mmol/L甘氨酸组细胞AMP/ATP比值较0.8 mmol/L甘氨酸组明显降低（ P<0.05）。干预6.5 h，正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L 甘氨酸组、1.2 mmol/L 甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达水平分别为1.001±0.037、0.368±0.020、1.153±0.019、1.128±0.062、1.028±0.037，0.96±0.07、0.63±0.12、1.17±0.13、1.13±0.16、1.11±0.11，0.98±0.06、0.45±0.08、1.13±0.05、0.77±0.12、0.51±0.13。与单纯烧伤血清组比较，正常血清组与各甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K和p-4E-BP1蛋白表达均明显升高（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，1.2 mmol/L甘氨酸组细胞p-4E-BP1蛋白表达以及1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1与p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05）；与1.2 mmol/L甘氨酸组比较，1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-4E-BP1蛋白表达均明显降低（ P<0.05），p-AMPK蛋白表达明显升高（ P<0.05）。与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞干预1.5、3.5、6.5 h微管蛋白表达均明显降低（ P<0.05），干预1.5、3.5 h HSP70表达和干预3.5、6.5 h MT表达均明显升高（ P<0.05）；单纯烧伤血清组与0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞干预1.5、3.5、6.5 h HSP70、MT表达以及干预1.5、3.5 h微管蛋白表达均明显低于0.8 mmol/L甘氨酸组（ P<0.05）。干预6.5 h，与正常血清组比较，单纯烧伤血清组细胞微管结构紊乱；0.8 mmol/L甘氨酸组细胞边界较单纯烧伤血清组清晰，微管结构近核部位排列整齐；与0.8 mmol/L甘氨酸组比较，0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞边界不清，微管结构紊乱。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，甘氨酸可通过AMP活化蛋白激酶显著上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70核糖体蛋白S6激酶/真核翻译起始因子4E结合蛋白1信号通路，促进心肌细胞保护性蛋白HSP70、MT和微管蛋白合成，稳定微管结构，实现心肌细胞保护作用。

目的:探讨邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）通过腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（AMP activated protein kinase/mammalian rapamycin target protein，AMPK/mTOR）信号通路对大鼠睾丸间质细胞（Leydig）凋亡的影响。方法:生殖功能损伤大鼠模型按照体质量排序分组法分为模型（DBP）组17只、模型+AMPK抑制剂［DBP+化合物C（compound C，CC）］组17只、模型+AMPK激动剂［DBP+二甲双胍（metformin，MF）］组17只、DBP+AMPK抑制剂+激活剂（DBP+CC+MF）组17只。另取11只大鼠作为空白组。空白组和DBP组腹腔注射等量生理盐水，DBP+CC组、DBP+MF组分别腹腔注射20 mg/kg CC、200 mg/kg MF，DBP+CC+MF组腹腔注射20 mg/kg CC+200 mg/kg MF，qd，连续4周。放射性免疫分析法检测各组血清黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、睾酮水平；全自动精子质量分析系统分析精子质量；HE染色法观察睾丸生精小管上皮细胞病变情况；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）法和流式细胞术检测Leydig细胞凋亡情况；RT-PCR法和Western blotting法检测AMPK、mTOR、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）mRNA和蛋白及p-AMPK、p-mTOR蛋白的表达。结果:与DBP组的血清FSH水平［（9.07±0.52）U/L］相比，DBP+MF组血清FSH水平［（9.88±0.67）U/L］升高，DBP+CC组［（6.82±0.60）U/L］降低，差异均有统计学意义（均 P<0.001）；与DBP组血清LH、睾酮水平、精子浓度及（a+b）级精子占比［（4.51±0.75）U/L、（3.25±0.11）mg/L、（16.46±3.40）×10 6/mL、（25.43±4.36）%］相比，DBP+MF组血清LH、睾酮水平及精子浓度、（a+b）级精子占比［（3.97±0.70）U/L、（2.96±0.11）mg/L、（13.15±2.63）×10 6/mL、（22.20±4.13）%］降低，DBP+CC组［（6.52±0.71）U/L、（4.48±0.15）mg/L、（25.47±2.18）×10 6/mL、（45.60±4.78）%］升高，差异均有统计学意义（DBP组比DBP+MF组 PLH=0.038，其余均 P<0.001）。HE染色显示，空白组睾丸组织结构正常；DBP组和DBP+CC+MF组生精小管上皮细胞萎缩、扭曲呈不规则形态，DBP+MF组病变更为严重，核周现大量空泡；DBP+CC组病变较DBP组有所改善。与DBP组Leydig细胞凋亡数、p-AMPK/AMPK蛋白及 Caspase 3 mRNA和蛋白相对表达量（142.40±26.78、0.70±0.07、1.85±0.14、0.80±0.09）相比，DBP+MF组Leydig细胞凋亡数、p-AMPK/AMPK及 Caspase 3 mRNA和蛋白相对表达量（286.60±30.17、0.95±0.08、2.17±0.18、1.23±0.10）升高，DBP+CC组（88.00±21.34、0.42±0.04、1.35±0.15、0.54±0.06）］降低，差异均有统计学意义（均 P<0.001）；与DBP组p-mTOR/mTOR（0.45±0.06）相比，DBP+MF组（0.23±0.04）降低，DBP+CC组（0.84±0.07）升高（均 P<0.001）。 结论:DBP可致大鼠生殖系统受损，Leydig细胞凋亡率升高，其机制可能与AMPK活化、mTOR抑制有关。

AMP活化蛋白激酶（AMPK）是一种广泛存在于真核细胞生物中且进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在调控细胞能量代谢方面，AMPK作为能量代谢激酶具有极其重要的作用。当机体处于低能量状态时，AMPK对细胞内腺嘌呤核苷酸水平的变化作出反应，与一磷酸腺苷（AMP）或二磷酸腺苷（ADP）结合后被激活。激活的AMPK可调控各种代谢过程，包括脂质、葡萄糖代谢和细胞自噬。AMPK可通过磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶-失调51样激酶1（ULK1）和Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶-空泡分选蛋白34（PIK3C3-VPS34）复合物中的自噬相关蛋白直接促进细胞自噬；也可通过调节叉头框蛋白O3（FOXO3）、溶酶体功能的转录因子EB（TFEB）和溴结构域蛋白4（BRD4）等转录因子下游自噬相关基因的表达间接促进细胞自噬；还可调节线粒体自噬，诱导受损的线粒体分裂，促进自噬反应向受损线粒体转移。AMPK另一个功能是调控线粒体健康，可通过刺激线粒体生物发生参与并调控线粒体内稳态的各个方面。本综述讨论了AMPK信号通道作为细胞响应能量应激和调控线粒体的中心，对线粒体生物学和内环境稳态的重要调控作用，重点介绍了AMPK在调节细胞自噬和线粒体自噬过程中的关键作用，以及调控线粒体稳态的研究进展。

目的:探讨消退素D1（resolvin D1, RvD1）通过调控自噬途径减轻猪心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, CPR）后脑损伤的作用机制。方法:国产雄性白猪19头，体质量30~41 kg。应用随机数字表法，将实验动物分为3组，即假手术（sham, S）组（ n = 5）、CPR组（ n = 7）与RvD1组（ n = 7）。S组动物仅进行气管插管、血管置管等操作准备，CPR组和RvD1组动物经右心室电刺激诱发心脏骤停8 min后CPR 5 min的方法建立实验模型。于复苏后5 min时，RvD1组动物经股静脉注射RvD1 0.6 μg/kg，S组和CPR组动物给予等量溶媒。于复苏后1、3、6和24 h时，采集静脉血标本，应用ELISA法检测神经元特异度烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）和S100β蛋白（S100β protein, S100β）。复苏后24 h进行神经功能缺损评分（neurological deficit score, NDS），然后安乐死并获取大脑皮层组织，应用western blot法检测磷酸化磷酸腺苷活化蛋白激酶（phosphorylated AMP-activated protein kinase, p-AMPK）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin, p-mTOR）、微管相关轻链蛋白3 II（microtubule-associated protein light chain 3, LC3 Ⅱ）和p62。三组间比较应用单因素方差分析和Bonferroni事后检验。 结果:与S组相比，CPR组和RvD1组动物复苏后24 h NDS显著升高，血清NSE和S100β显著增加（均 P < 0.05）。然而，与CPR组相比，RvD1组动物复苏后24 h NDS显著降低[（182±34）和（124±18）， P < 0.05]，在复苏3 h后血清NSE和S100β浓度显著减少[NSE（ng/mL）：3 h为（23.1±3.8）和（18.0±2.2），6 h为（27.3±2.9）和（19.8±1.4），24 h为（28.1±1.3）和（15.1±2.1）；S100β（pg/mL）：3 h为（1 611±208）和（1 322±100），6 h为（1 825±197）和（1 410±102），24 h为（1 613±138）和（1 183±139），均 P<0.05]。与S组相比，CPR组和RvD1组动物在复苏后24 h脑皮层p-AMPK与LC3II表达显著增加，p-mTOR与p62表达显著减少（均 P<0.05）。然而，与CPR组相比，RvD1组动物在复苏后24 h脑皮层p-AMPK与LC3Ⅱ表达显著减少、同时p-mTOR与p62表达显著增加[p-AMPK：（0.28±0.08）和（0.17±0.03）；LC3 Ⅱ：（0.33±0.09）和（0.21±0.04）；p-mTOR：（0.13±0.02）和（0.16±0.02）；p62：（0.16±0.05）和（0.22±0.02），均 P<0.05]。 结论:RvD1减轻猪CPR后脑损伤的保护机制可能与抑制AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬有关。

脓毒症的发生、发展及预后与机体免疫调控密切相关，免疫代谢是近年来脓毒症免疫干预的研究热点。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是机体代谢调控的经典信号通路，参与中性粒细胞趋化性、巨噬细胞极化、自然杀伤性细胞和树突状细胞的发育分化、T细胞发育及功能调节，是脓毒症免疫代谢调控的重要途径。本文就AMPK-mTOR信号通路调节免疫细胞代谢重编程参与脓毒症免疫调节的研究进展做一综述。

目的 探索Sestrin2(SESN2)通过介导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)信号通路调控软骨细胞自噬活性的机制.方法 利用白细胞介素-1β(IL-1β)处理正常软骨细胞制备骨性关节炎(OA)软骨细胞模型,并分为对照组和IL-1β处理组,通过实时定量PCR(qPCR)及Western印迹检测对照组和IL-1β处理组细胞基质金属蛋白酶13(MMP13)、Ⅱ型胶原(COL2A1)及SESN2的表达水平.通过细胞转染技术获得软骨细胞过表达SESN2组与敲低SESN2组细胞模型,并用qPCR检测各组SESN2表达水平,用Western印迹检测各组SESN2、MMP13、COL2A1、mTORC1通路相关蛋白及自噬相关蛋白表达水平,用CCK-8和细胞划痕实验检测各组SESN2对细胞增殖和迁移的影响.结果 (1)经IL-1β处理后的软骨细胞MMP13表达水平显著上调,COL2A1及SESN2表达水平显著下降.(2)与对照组相比过表达SESN2组OA软骨细胞p-mTORC1、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、MMP13蛋白表达显著下调,而5'-腺嘌呤核苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和软骨保护基因COL2A1表达显著上升、苄氯素-1(Beclin-1)表达水平及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)/(LC3-Ⅰ)比值增高,同时,过表达SESN2可上调软骨细胞增殖、迁移活性,敲低SESN2后结果则相反.结论 SESN2可以通过抑制mTORC1通路活性增强软骨细胞自噬、增殖及迁移活性,为揭示OA的发病机制及探寻新的治疗方法提供实验依据.

目的:探讨芪红胶囊基于蛋白激酶 B/腺苷酸活化蛋白激酶(AKT/AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠线粒体能量代谢的影响及调控机制.方法:将 36 只雄性 SD大鼠随机选取 6 只作为假手术组,另 30 只作为模型组.模型组采用冠状动脉左前降支结扎法制备 IHF模型.将造模成功的大鼠按体质量随机分为 5组:模型组、阳性药组、芪红胶囊低剂量组[QH-L组,0.324 g/(kg·d)]、芪红胶囊中剂量组[QH-M组,0.648 g/(kg·d)]、芪红胶囊高剂量组[QH-H组,1.296 g/(kg·d)],给予相应浓度的药物溶液灌胃,假手术组、模型组给予等体积的生理盐水(10 mL/kg),各组均每日灌胃 1次.连续干预 4 周后,选用 M型超声测定左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)、短轴缩短率(FS)判定心脏结构及心功能;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)染色法观察心肌组织病理形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清葡萄糖(Glu)、乳酸(LD)、酮体(KB)、游离脂肪酸(FFA)水平;线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1 法)检测细胞线粒体膜电位;线粒体通透性转换孔(mPTP)检测试剂盒检测其荧光强度;MitoSOXTMRed 线粒体超氧化物指示剂检测线粒体活性氧(ROS)的含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌组织 AKT、AMPK、mTOR的蛋白表达量.结果:与假手术组比较,模型组 LVEDD、LVESD、凋亡率、Glu、LD、FFA、KB、线粒体膜电位、ROS、磷酸化 AMPK(p-AMPK)蛋白表达水平均升高(P<0.05),LVEF、FS、mPTP及磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化 mTOR(p-mTOR)蛋白表达水平均下降(P<0.05);与模型组比较,芪红胶囊低、中、高剂量组和阳性药组 Glu、LD、FFA、KB、线粒体膜电位、ROS水平明显下降(P<0.05),线粒体 mPTP、p-AKT蛋白表达水平明显升高(P<0.05);芪红胶囊中、高剂量组 LVEDD、凋亡率、p-AMPK明显降低(P<0.05),LVEF、FS明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与芪红胶囊低剂量组比较,芪红胶囊高剂量组和阳性药组大鼠 LVEF、FS、线粒体mPTP、p-AKT水平明显升高,LVESD、ROS、p-AMPK表达水平下降(P<0.05).结论:芪红胶囊可以调节 IHF大鼠心肌代谢底物进程,减少 ROS的过度生成保护线粒体功能,激活 AKT上调 mTOR活性抑制细胞凋亡,减轻心肌细胞损伤,调控能量代谢,发挥心肌保护作用,其机制可能与AKT/AMPK-mTOR信号通路蛋白的表达有关.

目的 基于AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路探究下调miR-34a对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠的干预效果.方法 43只雄性SD大鼠随机选取10只作为空白组,其余33只建立NAFLD模型,成功建模30只分为模型组、上调miR-34a组、下调miR-34a组各10只,将10 μl miR-34a过表达慢病毒悬液、miR-34a沉默慢病毒悬液分别转染于上调miR-34a组、下调miR-34a组,其余两组进行同剂量蒸馏水干预,干预4 w后,进行葡萄糖耐受实验(OGTT),采集血清,检测血脂及胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),解剖肝脏、胰腺进行脏器系数计算,检测肝组织中miR-34a表达,苏木素-伊红(HE)染色进行肝组织病理学观察,检测AMPK/mTOR通路蛋白相对表达量.结果 与模型组相比,上调miR-34a组miR-34a表达量、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血糖、曲线下面积(AUC)、肝脏系数、脂肪变性、小叶内炎症、气球样变积分、胰腺系数、空腹胰岛素(FINS)、HOMA-IR、mTOR表达升高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平、AMPK表达降低,下调miR-34a组miR-34a表达量、TC、TG、LDL-C、血糖、AUC水平、肝脏系数、脂肪变性、小叶内炎症、气球样变积分、胰腺系数、FINS、HOMA-IR、mTOR表达下降,HDL-C水平、AMPK表达上升,具有统计学差异(P＜0.05);与上调miR-34a组相比,下调miR-34a组miR-34a表达量、TC、TG、LDL-C、血糖、AUC水平、肝脏系数、脂肪变性、小叶内炎症、气球样变积分、胰腺系数、FINS、HOMA-IR、mTOR表达下降,HDL-C水平、AMPK表达上升,具有统计学差异(P＜0.05).结论 下调miR-34a可改善NAFLD大鼠血脂代谢紊乱及胰岛素抵抗,其机制可能与调控AMPK/mTOR信号通路有关.

目的:探究大黄糖络丸(DHT)基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/unc-51样激酶1(AMPK/mTOR/ULK1)信号通路对糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)小鼠的干预作用.方法:40只造模成功的C57BL/KSJ-db/db(以下简称db/db)小鼠随机分为模型组,达格列净组(1.5 mg·kg-1·d-1),DHT 高、中、低剂量组(3.6、1.8、0.9 g·kg1·d-1),每组8 只;另取 10 只 C57BL/KSJ-db/dm(以下简称db/m)小鼠为正常组,正常组和模型组给予生理盐水,治疗组小鼠分别给予相应药物,连续给药10周,1次/d.于给药0、4、8、10周固定时间,禁食不禁水12 h,取尾静脉血检测空腹血糖(FBG);于给药0、5、10周末收集尿液检测尿中白蛋白、肌酐含量,计算尿白蛋白肌酐比值(ACR);给药10周后,检测各组小鼠24 h尿总蛋白,血肌酐(Scr),尿素氮(BUN)含量;蛋白免疫印迹法检测肾脏组织p-AMPK、p-mTOR及p-ULK1蛋白的表达水平,以及自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62蛋白的表达水平;免疫组化法检测肾脏组织足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin、Podocin)的表达水平;采用光学显微镜和透射电镜观察肾脏组织病理形态学变化.结果:与模型组比较,达格列净组和DHT组小鼠FBG、ACR、24 h尿总蛋白均降低,Scr、BUN无统计学差异;肾组织中p-AMPK、p-ULK 1表达水平升高,p-mTOR表达水平降低及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1表达水平升高,P62表达水平降低(P＜0.01,P＜0.05);肾小球的足细胞裂孔膜蛋白Neph-rin、Podocin 表达水平升高(P＜0.01,P＜0.05);肾脏病理损害减轻;透射电镜显示自噬小体、自噬溶酶体数量增加.结论:DHT可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路,增强足细胞自噬,保护肾小球,延缓DN发展进程.

目的:探讨蠲痹方含药血清对绝经后膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KO A)大鼠软骨细胞自噬的影响及其作用机制.方法:①绝经后KOA动物模型的建造和蠲痹方含药血清的制备.采用摘取大鼠卵巢,并切断膝关节内侧副韧带、前交叉韧带,摘除膝关节内侧半月板的方法,建造绝经后KOA大鼠模型.造模成功后,对模型大鼠进行蠲痹方浓缩液灌胃,制备蠲痹方含药血清.②大鼠软骨细胞的提取.分别取正常大鼠和模型大鼠的膝关节软骨分离、提取软骨细胞.③蠲痹方含药血清最佳作用浓度筛选.将模型大鼠软骨细胞分为模型组及1.25％、2.5％、5％、10％、20％含药血清组6组,除模型组外,其余各组分别加入相应体积分数的蠲痹方含药血清干预24 h.检测各组软骨细胞的活力,筛选蠲痹方含药血清最佳作用浓度.④蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞G蛋白耦联受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)表达影响的检测.将模型大鼠软骨细胞分为模型组及1.25％、2.5％、5％、10％含药血清组,并取正常大鼠软骨细胞设为空白组.除模型组和空白组外,其他各组软骨细胞用相应体积分数的蠲痹方含药血清干预24 h.检测各组大鼠软骨细胞GPR30的相对表达量.⑤蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞自噬相关蛋白表达和 AMP 活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路影响的检测.将模型大鼠软骨细胞分为模型组、含药血清组、含药血清+Compound C组、Compound C组,并取正常大鼠软骨细胞设为空白组.除模型组和空白组外,含药血清组、含药血清+Compound C组、Compound C组分别用10％蠲痹方含药血清、10％蠲痹方含药血清+Compound C及Compound C干预24 h.检测各组软骨细胞中自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3β(microtu-bule-associated protein light chain 3 beta,MAPLC3β)、Beclin-1、p62,及 AMPK/mTOR 信号通路相关蛋白磷酸化 AMP 活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapam-ycin,p-mTOR)的相对表达量.结果:①动物模型鉴定结果.造模8周后,可见造模大鼠膝关节表面软骨毛糙或缺损,关节间隙变窄,滑膜增生,绝经后KOA大鼠模型造模成功.②软骨细胞鉴定结果.甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光鉴定结果显示,所提取的细胞符合软骨细胞特征.③蠲痹方含药血清最佳作用浓度筛选结果.5％、10％、20％含药血清组细胞活力均高于1.25％、2.5％含药血清组和模型组(LSD-t=6.767,P=0.003,LSD-t=7.666,P=0.002,LSD-t=5.091,P=0.007;LSD-t=5.080,P=0.007,LSD-t=6.690,P=0.003,LSD-t=3.433,P=0.027;LSD-t=7.590,P=0.002,LSD-t=8.200,P=0.001,LSD-t=6.031,P=0.004);10％含药血清组细胞活力高于5％含药血清组和20％含药血清组(LSD-t=3.204,P=0.033,LSD-t=4.671,P=0.010).④蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞GPR30表达影响的检测结果.模型组GPR30相对表达量低于空白组及5％、10％含药血清组(LSD-t=5.695,P=0.005,LSD-t=5.400,P=0.006,LSD-t=9.006,P=0.001),5％、10％含药血清组 GPR30 相对表达量均高于1.25％含药血清组(LSD-t=2.782,P=0.049,LSD-t=4.473,P=0.011),10％含药血清组GPR30相对表达量高于2.5％含药血清组(LSD-t=4.544,P=0.011).⑤蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞自噬相关蛋白表达影响的检测结果.模型组、含药血清+Compound C 组、Compound C 组 MAPLC3β 相对表达量均低于空白组、含药血清组(LSD-t=6.855,P=0.002,LSD-t=8.675,P=0.001;LSD-t=5.096,P=0.007,LSD-t=5.931,P=0.004;LSD-t=5.560,P=0.005,LSD-t=5.354,P=0.006);模型组、Compound C 组 MAPLC3β 相对表达量均低于含药血清+Compound C 组(LSD-t=4.627,P=0.010,LSD-t=8.677,P=0.001).模型组、Com-pound C组Beclin-1相对表达量低于空白组、含药血清组、含药血清+Compound C(LSD-t=12.912,P=0.000,LSD-t=7.401,P=0.002,LSD-t=5.360,P=0.006;LSD-t=2.950,P=0.042,LSD-t=5.484,P=0.005,LSD-t=3.903,P=0.018);含药血清+Com-pound C组Beclin-1相对表达量低于空白组(LSD-t=26.840,P=0.000).含药血清组、空白组p62相对表达量低于模型组、含药血清+Compound C 组、Compound C 组(LSD-t=3.925,P=0.017,LSD-t=3.985,P=0.019,LSD-t=0.016,P=0.001;LSD-t=3.149,P=0.035,LSD-t=5.094,P=0.007,LSD-t=8.740,P=0.001),含药血清+Compound C 组 p62 相对表达量低于 Compound C组(LSD-t=3.455,P=0.026).⑥蠲痹方含药血清对大鼠软骨细胞AMPK/mTOR信号通路影响的检测结果.含药血清组p-AMPK相对表达量高于模型组、Compound C 组(LSD-t=3.623,P=0.022,LSD-t=6.537,P=0.003),空白组 p-AMPK 相对表达量高于模型组、含药血清+Compound C 组、Compound C 组(LSD-t=4.149,P=0.014,LSD-t=2.791,P=0.049,LSD-t=5.734,P=0.004),含药血清+Compound C组p-AMPK相对表达量高于Compound C组(LSD-t=5.958,P=0.004).空白组、含药血清组、含药血清+Compound C 组 p-mTOR 相对表达量均低于模型组(LSD-t=8.722,P=0.001,LSD-t=8.849,P=0.001,LSD-t=5.558,P=0.005),含药血清组、空白组p-mTOR相对表达量均低于含药血清+Compound C组、Compound C组(LSD-t=4.201,P=0.014,LSD-t=10.030,P=0.001;LSD-t=4.879,P=0.008,LSD-t=9.782,P=0.001),含药血清+Compound C 组 p-mTOR 相对表达量低于Compound C组(LSD-t=6.934,P=0.002).结论:蠲痹方含药血清作用于绝经后KOA大鼠软骨细胞,可增加细胞活力,并通过上调MAPLC3β、Beclin-1的表达和抑制p62的表达增强细胞自噬能力;其作用机制可能与促进GPR30表达,上调AMPK磷酸化水平,下调mTOR磷酸化水平,激活GPR30和AMPK/mTOR信号通路有关.