目的:探索开发一种靶向CLL-1的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）并验证其功能。方法:通过流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）细胞系和AML原代细胞CLL-1靶点的表达水平。构建CLL-1 CAR载体并制备出相应慢病毒，感染激活后T细胞生产出CAR-T细胞，并通过体外和体内实验验证CLL-1 CAR-T细胞的功能。结果:AML细胞系和原代AML细胞中均表达CLL-1。制备的CLL-1 CAR-T细胞转导率为77.82%，在AML细胞系以及AML原代细胞中，CLL-1 CAR-T细胞能明显特异性杀伤表达CLL-1的靶细胞系和原代肿瘤细胞。相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞在杀伤靶细胞和原代肿瘤细胞时分泌IL-6、IFN-γ等细胞因子水平更高（ P值均<0.001）。在AML人源性异种移植小鼠模型中，相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞表现出有效的抗白血病活性并延长小鼠存活时间[未达到对22（95% CI 19~24）d， P=0.002]。 结论:靶向CLL-1的CAR-T细胞成功开发并具有较好的肿瘤杀伤作用。

目的:探究重组磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）串联显性表位（PLA2RTD）在去除原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）抗PLA2R自身抗体（anti-PLA2R）中的作用。方法:在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞体系中表达重组蛋白分子PLA2RTD（富含半胱氨酸结构域、C型凝集素样结构域1和C型凝集素样结构域7），圆二色谱法测定PLA2RTD的二级结构，酶联免疫吸附测定法和免疫荧光法测定PLA2RTD的生物活性，环氧活化法耦联重组PLA2RTD与琼脂糖凝胶CL-6B微球以制备anti-PLA2R的特异性免疫吸附剂。结果:该研究实现了PLA2RTD在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞系统中的首次表达，证明了PLA2RTD具有良好的免疫原性和较高的结合特异性。PLA2RTD免疫吸附剂体外单次吸附可平均消除76.66%的anti-PLA2R［（6.66±0.30）RU/ml比（28.54±2.10）RU/ml］，吸附完成后血浆中IgG、IgA、白蛋白、β2微球蛋白、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的含量变化<4%，第2～3次重复使用时仍可保持65%左右的吸附效率。结论:基于PLA2RTD的特异性免疫吸附剂能够有效地清除血浆中anti-PLA2R，为特异性清除与PMN相关的自身抗体提供了一种新途径。

目的:探讨程序性死亡受体配体1(PD-L1)对CLL-1 CAR-T细胞抗急性髓系白血病(AML)作用的影响。方法:通过构建PD-L1表达载体、制备慢病毒、转导、单克隆筛选技术获得稳定表达PD-L1的THP-1单克隆细胞株(THP1-PDL1)，然后以前期制备的CLL-1 CAR-T细胞为效应细胞，以THP-1、THP1-PDL1单克隆细胞株作为靶细胞，分别通过LDH检测、CBA法、CFSE法评价PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞裂解功能、炎性因子释放、细胞增殖等功能的影响。结果:①成功制备了PD-L1慢病毒，并筛选获得了稳定表达PD-L1的THP1-PDL1单克隆细胞株，流式细胞术及PCR验证成功。②PD-L1过表达抑制了CLL-1 CAR-T细胞裂解THP-1细胞的能力；效靶比为10∶1时，CLL-1 CAR-T细胞对THP1-PDL1细胞的杀伤效率明显低于对THP-1细胞的杀伤效率[(15.70±9.90)%对(51.95±2.52)%， P<0.05]。③PD-L1过表达减弱了CLL-1 CAR-T细胞释放细胞因子的能力[与THP1-PDL1细胞共培养时对与THP-1细胞共培养时：IFN-γ(115.66±3.13)pg/ml对(1708.16±26.76)pg/ml， P<0.05；IL-6(17.37±0.72)pg/ml对(124.92±4.26)pg/ml， P<0.05；IL-10(5.69±0.13)pg/ml对(124.12±3.02)pg/ml， P<0.05]；同时抑制了CLL-1 CAR-T细胞的增殖能力。 结论:成功构建了表达PD-L1的THP1-PDL1单克隆细胞株，同时证实了PD-L1过表达对CLL-1 CAR-T细胞抗AML的不利的影响，为通过PD-1/PD-L1通路调控CLL-1 CAR-T细胞功能提供了一定的理论基础。

烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是最普遍的空气传播真菌病原体,可导致免疫功能低下患者发生致命的侵袭性曲霉病.对病原体与宿主免疫系统的相互作用过程的了解是理解其致病性的关键.通过保守的跨膜或可溶性的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别病原体表面上的保守分子结构,称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs).C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLRs)是PRRs中主要受体家族之一,CLRs可以通过C型凝集素样结构域(C-type lectin-like domains,CTLDs)来识别β-葡聚糖、甘露糖、几丁质等真菌细胞壁成分,从而诱导固有免疫和获得性免疫来清除病原体.目前烟曲霉中所涉及的CLRs主要为Dectin-1、Dectin-2、MelLec、DC-SIGN等,这些CLRs在宿主细胞识别烟曲霉中起着至关重要的作用,并且针对Dectin-1及Dectin-2已开发出新型抗烟曲霉药物.因此为了进一步了解与烟曲霉相关的各类CLRs的作用机制及其相关信号通路,为开发新型抗真菌药物提供一种新思路,文章对与烟曲霉相关的CLRs最新研究进展进行了综述.

目的:免疫细胞的异常程序性死亡与自身免疫性疾病相关,但系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE),尤其是狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)的程序性死亡模式尚不清楚.本研究旨在探究SLE和LN与免疫细胞死亡模式的关联.方法:在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载批量RNA测序(bulk RNA sequencing,bulk RNA-seq)和单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)数据,通过生物信息学分析探究SLE患者外周血单个核细胞中3种细胞死亡模式相关基因的表达水平;通过scRNA-seq确定参与细胞死亡模式失衡的关键细胞亚群;采用免疫荧光法检测树突状细胞(dendritic cell,DC)中受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶3(receptor interacting serine/threonine kinase 3,RIPK3)、混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein、MLKL)、磷酸化MLKL(phosphorylated MLKL,pMLKL)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase 1、CASP1)、CD1c分子(CD1c molecule、CD1C)、含C型凝集素结构域 9A(C-type lectin domain containing 9A、CLEC9A)和X-C基序趋化因子受体1(X-C motif chemokine receptor 1,XCR1)的表达水平;对中南大学湘雅三医院收集的LN患者和健康对照者(healthy control,HC)的肾组织进行scRNA-seq,并通过生物信息学分析参与细胞死亡模式失衡的关键细胞亚群;采用拟时序分析和配受体分析探究不同DC亚群的分化方向和细胞通信.采用瞬时转染技术分别在RAW264.7细胞中转染空质粒、空质粒+dsDNA(HSV-DNA)、空质粒+200 μmol/L叔丁基过氧化氢(tert-butyl-hydroperoxide,TBHP)、STING shRNA质粒、STING shRNA质粒+dsDNA(HSV-DNA)、STING shRNA质粒+200 μmol/L TBHP;采用Annexin V-mCherry和SYTOX Green染色检测各组细胞死亡情况;蛋白质印迹法检测各组CASP1、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、RIPK3和MLKL的活化情况.结果:生物信息学分析显示SLE和LN患者存在3种细胞死亡模式的失衡:促炎型细胞焦亡和坏死性凋亡被激活,抗炎型细胞凋亡被抑制.其中的关键细胞亚群为DC亚群,并聚焦于CLEC9A+cDC1.免疫荧光法结果显示在外周血中SLE组DC中RIPK3、MLKL和CASP1表达水平较HC组DC升高;通过CLEC9A和XCR1标记肾组织中的cDC1,结果显示LN组cDC1的pMLKL和CASP1表达水平高于HC组.拟时序分析和配受体分析提示LN肾组织中CLEC9A+cDC1亚群存在外周循环起源.Annexin V-mCherry和SYTOX Green染色结果显示,在RAW264.7细胞中,与转染空质粒组相比,转染STING shRNA质粒组的死亡细胞数目减少;蛋白质印迹法结果显示与转染空质粒组相比,转染STING shRNA质粒组CASP1、GSDMD、RIPK3和MLKL的活化减少.结论:本研究为CLEC9A+cDC1在SLE和LN的细胞死亡模式失衡中的作用提供了新的思路.

目的:运用网络药理学、分子对接探讨异功散治疗支气管哮喘(BA)作用机制.方法:通过BATMAN-TCM、中医药百科全书(ETCM)平台、SymMap、TCM Database@Taiwan、中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)获取异功散各药物的潜在活性成分及对应靶点;利用 DisGeNET、TTD、GeneCards、PharmGkb、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、NCBI、人类表型本体(HPO)和Drugbank数据库收集BA疾病作用靶点,使用Bioinformatics&Evolutionary Genomics平台筛选药物与疾病共有靶点;利用GEO下载基因芯片,使用R语言分析获取差异表达基因,通过药物与疾病共有靶点基因交叉验证获得关键靶点,构建"活性成分-关键靶点"网络;使用R软件对关键靶点进行基因本体论(GO)生物功能分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析;采用STRING数据库和Cytoscape软件获得关键靶点蛋白相互作用关系,筛选出核心靶点;通过AutoDock软件进行核心靶点与活性成分的分子对接验证.结果:共筛选 176 个药物活性成分及其对应的作用靶点 265 个,获得差异基因 1 263 个,交叉验证得到原癌基因 1(PIM1)、人肾上腺素能受体β2(ADRβ2)、V-rel网状内皮细胞病毒癌基因同源物A(RELA)、碳酸酐酶 2(CA2)基因、肿瘤坏死因子(TNF)等 16 个关键靶点,关联的活性成分有槲皮素、甘草查尔酮A、甘草查尔酮B、山柰酚、柚皮素等.异功散治疗BA的关键靶点主要富集通路有NOD样受体信号通路、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路等.分子对接结果显示,TNF、RELA、白细胞介素 1A(IL1A)、连环蛋白β1(CTNNβ1)、螺旋环螺旋结构域扩散激酶(CHUK)、CXC型趋化因子配体 2(CXCL2)、磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)、信号转导子和转录激活子 1(STAT1)等核心靶点与槲皮素、甘草查尔酮A、甘草查尔酮B、山柰酚、柚皮素等活性成分均具有良好的结合能力.结论:异功散中槲皮素、甘草查尔酮A、甘草查尔酮B等成分可通过PIM1、ADRβ2 等多靶点调控NOD样受体、C型凝集素受体信号通路、TNF信号通路等治疗BA.

树突状细胞相关C型凝集素1(dectin-1)受体是真菌细胞壁上β葡聚糖的主要模式识别受体.Dectin-1广泛表达于树突状细胞(DC)、巨噬细胞及中性粒细胞等髓样细胞,在与内、外源性配体结合后,dectin-1能够诱导自身胞内信号传导触发一系列的细胞免疫反应,参与机体抗感染及抗肿瘤等过程.Dectin-1与其不同配体之间的相互作用,触发了不同的信号活化途径和细胞功能;与β葡聚糖的识别促进DC的成熟和向T细胞递呈抗原的能力,诱导细胞毒性T淋巴细胞的增殖,激活机体的特异性免疫应答进而发挥抗肿瘤作用.我们主要总结了 dectin-1分子的结构、信号通路及其在抗肿瘤免疫中的研究进展.

目的 基于网络药理学方法、分子对接技术及动物实验研究验证广西名老中医、岐黄学者卢健棋教授所创强心汤治疗CHF分子作用机制.方法 首先检索TCMSP数据库与相关文献查找强心汤组成的重要化合物;通过TCMSP数据库和STITCH数据库查找强心汤组成作用靶点;运用GeneCards、DisGeNET与OMIM等数据库获取CHF的主要靶点;进一步选择Venny平台取得两者的交集靶点;使用STRING平台和Cytoscape 3.6.1构建"成分-靶点"网络与强心汤靶点-CHF靶点的PPI网络;利用DAVID 6.8数据库进行GO富集分析和KEGG通路富集分析;使用AutoDock Vina软件进行分子对接.最后构建结扎大鼠左冠状动脉前降支法造成AMI后CHF模型,采用免疫蛋白印迹法检测核心靶点蛋白表达.结果 通过网络药理学研究方法得到槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、丹参酮(Tanshinone Iia)与柚皮素(Naringenin)等185个重要活性成分,核心靶点为信号转导和转录活化因子3(STAT3)、结核分枝杆菌调节蛋白(RELA)、磷酸化蛋白激酶1(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)和白细胞介素6(IL-6)等100个治疗靶点,初步表明强心汤可能通过调控脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、肿瘤坏死因子、IL-17、HIF-1、松弛素和C型凝集素受体等信号通路对细胞因子介导的信号通路、基因表达的正向调控、对缺氧的反应、对脂多糖的反应、对药物的反应等生物过程进行调节,发挥治疗CHF的作用.分子对接结果表明,强心汤组成的重要化合物与核心作用靶点均表现有强烈的结合能力;动物实验研究结果表明,强心汤成分能显著降低STAT3蛋白与MAPK1蛋白的磷酸化表达水平和IL6蛋白的表达水平(P<0.05),强心汤高剂量组略优于低剂量组.结论 本研究初步阐明强心汤可以通过降低STAT3蛋白与MAPK1蛋白磷酸化和IL6蛋白表达水平起到治疗CHF的作用,也验证了强心汤有多组成、多靶点、多途径协同作用治疗CHF的特点,动物实验为临床医师治疗CHF临床用药及进一步研究提供实验理论依据.

目的 基于网络药理学探讨桃核承气汤治疗脓毒症可能的活性成分、关键靶点及作用通路.方法 通过TCMSP、ETCM、BATMAN-TCM、TCMID数据库检索并筛选出桃核承气汤的活性成分及作用靶标;检索GEO、DisGene、GeneCards数据库获取脓毒症相关疾病靶标;通过交集分析获得两者的共同靶标,确定为桃核承气汤治疗脓毒症的潜在靶标,应用Cytoscape 3.8.2 软件构建中药-活性成分-潜在靶标调控网络.通过STRING 11.0 数据库对潜在靶标进行PPI分析并获取关键靶标,应用Metascape数据库对关键靶标进行GO富集分析,通过Cytoscape 3.8.2 软件的ClueGO和CluePedia插件进行关键靶标的KEGG通路富集分析.结果 最终获得169 药物活性成分,391 个作用靶标,3 525 个脓毒症相关靶标.通过取交集获得桃核承气汤治疗脓毒症可能的潜在靶标238 个,对PPI网络进行分析最终获得58 个关键靶标.GO富集分析在生物学过程、分子功能两个方面分别获得20 个聚类结果,在细胞组分方面获得了14 个聚类结果.KEGG通路富集分析共获得11 个相关通路.结论 桃核承气汤可能通过槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、芒柄花素、紫杉叶素、儿茶素、常春藤素等活性成分,作用于MAPK3、AKT1、MAPK1、JUN、IL6、STAT3、TP53、EG-FR、MYC、RELA、TNF、VEGFA等靶标蛋白,调节IL-17、Th17 细胞分化、NOD样受体、C型凝集素受体、HIF-1 等相关通路,进而影响炎症反应、细胞凋亡、免疫调节、血管屏障构建等生物过程而发挥治疗脓毒症的作用.

目的 探讨花旗松素(TAX)对自发性高血压大鼠(SHR)心肌肥厚的影响及分子机制.方法 24只SHR分为SHR对照组(SHR组)、TAX组(20 mg/kg)、TAX+PERK激活剂CCT020312(CCT)组(20 mg/kg TAX+2 mg/kg CCT),每组 8 只;另选 8 只正常血压Wistar-Kyoto(WKY)大鼠作为正常对照组(WKY组),给予相应的药物持续干预 8 周.实验过程中观察大鼠血压变化,并于干预结束后超声心动图检测大鼠舒张期室间隔厚度(IVSd)、收缩期室间隔厚度(IVSs)、左心室射血分数(LVEF)判断心肌肥厚程度和心脏功能,计算心脏指数、左心室指数,苏木精-伊红(HE)染色、小麦胚芽凝集素(WGA)染色和Masson染色评估心肌组织病理学变化,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测心肌组织中心房钠尿肽(ANP)、B型利钠肽(BNP)、I型胶原蛋白α1 链(COL1A1)和Ⅲ型胶原蛋白α1 链(COL3A1)mRNA表达,Western blot 检测心肌组织蛋白激酶 R 样内质网激酶(PERK)-转录激活因子 4(ATF4)通路相关蛋白表达.结果 干预结束后,与WKY组相比,SHR组收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、IVSd、IVSs、心脏指数、左心室指数、心肌细胞横截面积、胶原容积分数(CVF)、心肌组织ANP、BNP、COL1A1 和COL3A1 mRNA表达、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、ATF4、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白水平和p-PERK/PERK比值升高(均P<0.05),LVEF降低(P<0.05);与SHR组相比,TAX组SBP、DBP、IVSd、IVSs、心脏指数、左心室指数、心肌细胞横截面积、CVF、心肌组织ANP、BNP、COL1A1和COL3A1 mRNA表达、GRP78、ATF4、CHOP蛋白水平和p-PERK/PERK比值降低(均P<0.05),LVEF升高(P<0.05);CCT020312可部分逆转TAX对心脏功能和心肌肥厚的保护作用.结论 TAX可通过抑制内质网应激(ERS),改善高血压心肌肥厚,其作用机制可能与抑制PERK-ATF4通路有关.