目的:探讨一氧化氮（Nitric Oxide，NO）缓释二氧化硅纳米颗粒（简称NO缓释剂）对内镜生物膜的清除效果及其临床应用评价。方法:选择院内临床使用中的消化内镜160件，随机分为两组：清洗剂组80件，采用清洗剂对内镜进行消毒处理；NO组80件，采用NO缓释剂对内镜进行消毒处理。另建模型组，采用铜绿假单胞菌生物膜模型，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）处理，作为对照。先在体外层面，构建内镜管腔铜绿假单胞菌生物膜模型，经NO缓释剂处理后采用扫描电镜观察生物膜微结构，采用活菌计数法分析NO缓释剂对生物膜细菌的清除效果，再在临床层面，通过分析清洗后临床内镜的蛋白残留测定、菌落计数及ATP生物荧光检测评价NO缓释剂对内镜的实际消毒效果。结果:扫描电镜观察，模型组生物膜完整，NO组和清洗剂组生物膜表面可见散落杆菌。平均标准菌落数，与模型组［（4.86±2.67）×10 6菌落形成单位（colony-forming units，CFU）/mL］比，NO组［（1.37±0.61）×10 4CFU/mL］和清洗剂组［（1.31±0.21）×10 5CFU/mL］均显著降低（清洗剂组比模型组， P=0.009；NO组比模型组， P=0.008），且NO组比清洗剂组更低，组间差异有统计学意义（清洗剂组比NO组， t=9.53， P=0.000 6）。临床消化内镜层面，残留蛋白，NO组处理前后分别为（8.03±1.47）mg/mL、（0.50±0.37）mg/mL，清洗剂组处理前后分别为（8.01±1.51）mg/mL、（0.91±0.52）mg/mL，各组处理前后比较差异有统计学意义（ P<0.01），且NO组降低幅度更大。临床内镜分别经NO缓释剂与清洗剂处理，NO组与清洗剂组的消毒在合格范围内，但NO组的ATP生物荧光值［（78.56±42.59）RLU］、蛋白残留量［（0.50±0.37）mg/mL］与菌落计数量［（7.55±4.56）CFU］均显著低于清洗剂组［（120.80±54.00）RLU，（0.91±0.52）mg/mL，（11.50±4.75）CFU］，差异均有统计学意义（ P均<0.01）。 结论:NO缓释剂能够有效清除内镜生物膜，提高内镜消毒效果，可能对改善患者的诊疗效果及预后具有重要意义。

目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:探讨结核分枝杆菌（MTB）蛋白Rv0309促进耻垢分枝杆菌（Ms）在巨噬细胞胞内存活的分子调节机制。方法:以Ms为研究结核分枝杆菌的模型，构建带有对照组pMV261-3*flag空载质粒和实验组pMV261-Rv0309-3*flag质粒的重组Ms并感染RAW264.7细胞。通过计数菌落形成单位（CFU），探索蛋白Rv0309对Ms胞内存活的影响。通过质谱法筛选蛋白Rv0309与宿主相互作用的蛋白，采用免疫共沉淀法（Co-IP）验证宿主蛋白STUB1可与蛋白Rv0309相互作用。敲减RAW264.7细胞 STUB1基因后感染Ms，计数CFU，探索 STUB1基因敲减后，蛋白Rv0309对Ms胞内存活的影响。敲减RAW264.7细胞 STUB1基因后感染Ms，收样后进行Western blot实验，探索 STUB1基因敲减后，蛋白Rv0309对巨噬细胞自噬功能的影响。使用GraphPad Prism 8 软件进行统计分析，本实验选择 t检验进行分析，以 P<0.05为差异有统计学意义。 结果:Western blot显示蛋白Rv0309表达于耻垢分枝杆菌体内并分泌到胞外。感染THP-1巨噬细胞实验在24 h时实验组Ms-Rv0309的CFU高于对照组Ms-pMV261，差异有统计学意义（ P<0.05）。感染RAW264.7巨噬细胞实验结果趋势与感染THP-1巨噬细胞相同。免疫共沉淀（Co-IP）结果显示免疫沉淀（IP）：Flag和IP：HA结果中出现对应的Flag和HA条带。敲减 STUB1的实验组（siRNA- STUB1组）CFU水平显著高于未敲减 STUB1对照组（NC组）CFU；与对照组Ms-pMV261相比，Ms-Rv0309组CFU均显著高于Ms-pMV261组。实验组Ms-Rv0309的LC3Ⅱ条带在对应时间灰度均浅于对照组Ms-pMV261，8 h时结果最显著（LC3Ⅱ/β-actin：0.76±0.05 vs 0.47±0.07），差异有统计学意义（ P<0.05）。siRNA- STUB1组LC3Ⅱ条带在对应时间灰度均浅于NC组；对比Ms-pMV261和Ms-Rv0309菌株感染的CFU结果发现，与Ms-pMV261组相比，在对应时间LC3Ⅱ条带灰度Ms-Rv0309组更浅。 结论:MTB蛋白Rv0309能够成功表达于耻垢分枝杆菌并分泌到胞外，可抑制巨噬细胞的自噬过程。蛋白Rv0309与宿主蛋白STUB1相互作用，抑制巨噬细胞自噬促进Ms胞内存活。

目的 探讨双歧杆菌四联活菌片对2型糖尿病患者胰岛素敏感性和肠道菌群及糖脂代谢的影响.方法 选择2020年2月至2022年2月来唐山市协和医院就诊的2型糖尿病患者,随机分为对照组(43例)和观察组(42例).对照组选用二甲双胍进行治疗,观察组在对照组的基础上加用双歧杆菌四联活菌片治疗.比较两组治疗前后胰岛功能、肠道菌群、糖脂代谢指标的变化.结果 治疗前,两组患者肠道各菌群菌落形成单位(CFU)对比,差异无统计学意义(P＞0.05).治疗后,两组双歧杆菌、乳酸杆菌CFU较治疗前均升高,肠球菌、肠杆菌CFU较治疗前均降低(P＜0.05).治疗后,两组患者的空腹胰岛素、胰岛β细胞功能指数均升高,胰岛素抵抗指数均下降,且观察组的空腹胰岛素、胰岛β细胞功能指数更高,而胰岛素抵抗指数更低(P＜0.05);两组患者的空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白均降低,且观察组各指标明显低于对照组(P＜0.05);两组患者总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油较治疗前降低,高密度脂蛋白胆固醇较治疗前上升,且观察组四指标优于对照组(P＜0.05).结论 双歧杆菌四联活菌片能够增强2型糖尿病患者的胰岛素敏感性,改善肠道菌群及糖脂代谢.

目的 利用中性粒细胞杀菌活性试验,检测毒力基因rmpA、rmpA2阳性和拉丝试验阳性的高毒力肺炎克雷伯菌抗中性粒细胞杀菌能力,验证该试验鉴定高毒力肺炎克雷伯菌的可行性.方法 收集浙江省2016年1月至2017年7月期间临床血流感染分离的150株非重复肺炎克雷伯菌.采用PCR检测碳青霉烯类抗生素耐药基因(blaKPC,blaNDM,blaIMP-1,blaIMP-2)、荚膜血清型(K1,K2,K5,K20,K54,K57)和毒力基因(rmpA,rmpA2,iucA,iroN).将拉丝试验阳性和毒力基因rmpA、rmpA2阳性的菌株定义为高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP),拉丝试验和毒力基因rmpA、rmpA2阴性的菌株定义为经典肺炎克雷伯菌(cKP).采用中性粒细胞杀菌活性试验检测肺炎克雷伯菌的毒力,细菌的存活率计算方式为:加中性粒细胞共孵育的实验组菌落形成单位(CFU)/不加中性粒细胞共孵育的对照组CFU.结果 150株肺炎克雷伯菌中检测到65株携带rmpA2毒力基因,占43.3％.在rmpA2阳性菌株中,rmpA、iroN、blaKPC和K2的检出率分别为73.8％、80.0％、75.4％和40.0％,拉丝试验阳性率为36.9％;中性粒细胞杀菌试验中,hvKP组菌株和cKP组菌株的存活率分别为0.866±0.056和0.368±0.058,两组存活率差异有统计学意义(P<0.001).结论 分离自浙江省携带rmpA、rmpA2毒力基因和拉丝试验阳性的hvKP经中性粒细胞处理后仍有非常高的存活率,中性粒细胞杀菌活性试验阳性,该试验是一个鉴定肺炎克雷伯菌毒力简单有效的方法.

目的 研究角膜胶原交联术(CXL)在治疗真菌性角膜炎过程中的疗效.方法 选择6～8周龄雄性SPF级C57B L/6小鼠80只,制作腐皮镰孢菌性角膜炎模型,其中40只用于角膜真菌活性的检测,40只用于疗效观察,均以左眼为实验眼.角膜真菌活性的检测中将40只小鼠按照随机数字表法分为假手术组(不接种菌丝)、模型对照组、去上皮组(造模后刮除角膜上皮)和交联治疗组(去上皮联合交联治疗),各组小鼠分别于造模后3d用裂隙灯显微镜对术眼角膜炎症进行评分,并行角膜组织的载菌量计数.交联疗效观察实验中,应用随机数字表法将40只小鼠随机分为假手术组(不接种菌丝)、模型对照组、去上皮组和交联治疗组(去上皮联合交联治疗).4个组小鼠分别于造模后连续7d行裂隙灯显微镜下术眼角膜炎症评分及眼前节数码照相.造模后14d,裂隙灯显微镜下对术眼角膜炎症单项评分后,行组织病理学检查及炎症细胞计数.结果 造模后交联治疗组小鼠角膜载菌量最低,各组角膜载菌量的总体比较,差异有统计学意义(F=11.97,P=0.00),交联治疗组角膜载菌量平板计数与角膜炎症评分呈明显正相关(r=0.723,P=0.043).交联治疗组各时间点小鼠的角膜炎症评分明显低于模型对照组,3个组间和不同时间点角膜炎症评分的总体比较,差异均有统计学意义(F分组=34.44,P=0.00;F时间=17.49,P=0.00).造模后14d,去上皮组和交联治疗组小鼠角膜病灶面积和溃疡程度评分均明显低于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).角膜组织病理学检查显示,模型对照组小鼠角膜水肿,部分角膜基质溶解坏死,去上皮组于造模后角膜炎症表现较轻.交联治疗组小鼠角膜炎症反应最轻微,造模后7d角膜炎症接近痊愈.假手术组角膜基质内细胞很少;模型对照组基质增厚,基质内炎症细胞增多,可以确认的中性粒细胞占基质所有细胞总数的73.65％;去上皮组中性粒细胞百分比为59.33％;交联治疗组中性粒细胞百分比为11.29％.结论 CXL可以有效抑制小鼠角膜真菌活性,减轻真菌诱导的角膜炎症反应.

目的 通过阻断小鼠体内T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim3)/Galectin9通路,研究Tim3/Galectin9通路在结核菌感染中的调控作用.方法 利用Tim3和Galectin9功能性单抗阻断Tim3/Galectin9通路,1.0×106CFU H37Rv经腹腔注射感染C57BL/6雌性小鼠,感染4周后观察肺部大体情况和肺组织病理改变;流式细胞术检测小鼠外周血中Th1细胞干扰素-γ(IFN?γ)等细胞因子的表达情况;采用平板计数法计算脾脏和肺脏组织荷菌数CFUs.结果 小鼠感染后,经Tim3、Galectin9功能性单抗阻断Tim3/Galectin9通路的小鼠肺部肉芽肿病变明显减轻,脾脏和肺脏的荷菌量均较IgG control对照组低,流式细胞术结果显示CD4+T细胞的IFN?γ表达量相比IgG control感染对照组增多,差异有统计学意义(P<0.05).结论 结核分枝杆菌感染中,通过功能性单抗阻断Tim3/Galectin9通路可缓解结核病理状态,有效提高机体免疫水平,抑制结核的发生发展.

本研究的目的在于制备由Tat肽和麦胚凝集素修饰 (WGA) 修饰的脂质体递送系统,有效发挥抗菌效应.分别对其理化性质、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 的最低抑菌浓度 (MIC)、杀菌动力学、细胞摄取、生物膜形成抑制以及体内抗菌效果进行评价.研究结果表明,由Tat和WGA双修饰的载克拉霉素脂质体具有最低的MIC值和杀菌曲线,流式细胞实验结果表明双修饰的脂质体可将更多的香豆素6导入细菌内部.此外,该脂质体还能有效抑制MRSA生物膜的形成.体内实验结果表明,经过双修饰脂质体给药,小鼠脓肿部位的MRSA菌落数显著低于其他组 (P＜0.01),即具有最强的体内抗菌效果.总之,由Tat和WGA修饰的脂质体递送系统希望称为有效的抗耐药菌感染的策略.

Transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs) from human umbilical cord blood (hUCB) holds great promise for treating a broad spectrum of hematological disorders including cancer.However,the limited number of HSCs in a single hUCB unit restricts its widespread use.Although extensive efforts have led to multiple methods for ex vivo expansion of human HSCs by targeting single molecules or pathways,it remains unknown whether it is possible to simultaneously manipulate the large number of targets essential for stem cell self-renewal.Recent studies indicate that N6-methyladenosine (m6A) modulates the expression of a group of mRNAs critical for stem cell-fate determination by influencing their stability.Among several m6A readers,YTHDF2 is recognized as promoting targeted mRNA decay.However,the physiological functions of YTHDF2 in adult stem cells are unknown.Here we show that following the conditional knockout (KO) of mouse Ythdf2 the numbers of functional HSC were increased without skewing lineage differentiation or leading to hematopoietic malignancies.Furthermore,knockdown (KD) of human YTHDF2 led to more than a 10-fold increase in the ex vivo expansion of hUCB HSCs,a fivefold increase in colony-forming units (CFUs),and more than an eightfold increase in functional hUCB HSCs in the secondary serial of a limiting dilution transplantation assay.Mapping of m6A in RNAs from mouse hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) as well as from hUCB HSCs revealed its enrichment in mRNAs encoding transcription factors critical for stem cell self-renewal.These m6A-marked mRNAs were recognized by Ythdf2 and underwent decay.In Ythdf2 KO HSPCs and YTHDF2 KD hUCB HSCs,these mRNAs were stabilized,facilitating HSC expansion.Knocking down one of YTHDF2's key targets,Tal1 mRNA,partially rescued the phenotype.Our study provides the first demonstration of the function of YTHDF2 in adult stem cell maintenance and identifies its important role in regulating HSC ex vivo expansion by regulating the stability of multiple mRNAs critical for HSC self-renewal,thus identifying potential for future clinical applications.

目的 构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株,对其体外增殖、细胞侵袭及溶血活性特征变化进行研究,为通过封闭Fur蛋白表达治疗金黄色葡萄球菌感染提供新的实验依据. 方法 采用Gateway同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株,采用分光光度法检测其体外增殖活性变化;采用万古霉素保护试验检测其对A 549肺腺癌细胞株侵袭力的变化;观察其在血琼脂培养基上的溶血活性变化;采用实时荧光定量PCR检测fur缺失株a溶血素(hla)基因mRNA表达水平变化. 结果 成功构建金黄色葡萄球菌Newman株fur基因缺失株并通过PCR方法和测序方法验证.与Newman野生株相比,同一时间点侵入A 549肺腺癌细胞株内fur缺失株菌量(2 950CFUs/ml)显著少于野生株(20 100 CFUs/ml,P＜0.01),缺失株体外增殖活性及溶血活性显著减弱,且hla基因mRNA相对表达量(0.067)显著低于野生株(0.270) (P＜0.05). 结论 金黄色葡萄球菌fur缺失株在富铁条件下的增殖活性、细胞侵袭力及溶血活性均显著降低,对环境铁浓度感应及利用能力明显降低,Fur蛋白可能作为抗金黄色葡萄球菌感染治疗的新靶点.