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CRISPR/Cas系统中工程化gRNA技术的研究和应用
编辑人员丨2天前
CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具.其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达.作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域.随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了 gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力.基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性.
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编辑人员丨2天前
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茵陈水提物对多药耐药蛋白3基因突变致新生儿肠外营养相关性胆汁淤积的保护作用
编辑人员丨2天前
目的 探讨茵陈水提物对多药耐药蛋白 3(MDR3)基因突变导致的新生儿肠外营养相关性胆汁淤积(PNAC)的保护作用及可能机制.方法 ①将人原代培养肝细胞应用体外细胞培养、CRISPR/Cas9 慢病毒感染、MDR3 突变基因导入等技术处理后,比较 1%脂肪乳诱导处理前(0)和处理后 16、32、48 h不同时间点肝细胞上清液中肝胆生化指标[丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(IBil)、总胆汁酸(TBA)]的水平,确定构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间.②将人原代培养肝细胞株按随机数字表法分为空白对照组、MDR3 基因野生型组、MDR3 基因突变组、茵陈水提物干预组.空白对照组只用培养液处理,MDR3 基因野生型组应用慢病毒感染融入野生型MDR3基因和培养液培养,MDR3 基因突变组应用慢病毒感染慢病毒导入MDR3(c.485T>A、c.2793insA、c.1031G>A、c.3347G>A)突变基因和培养液培养,茵陈水提物干预组应用慢病毒感染导入MDR3 突变基因和培养液培养的基础上,加入 100 g/L茵陈水提物预处理,然后将 4 组肝细胞分别加入 1%脂肪乳诱导处理,处理时间为构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需时间.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定 4 组肝细胞上清液中肝胆生化(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测4组肝细胞编码MDR3、胆盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白(MRP)2~4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的三磷酸腺苷结合盒蛋白(ABCB4、ABCB11、ABCC2、ABCC3、ABCC4)和TNF基因mRNA的表达丰度.结果 与空白对照组和MDR3基因野生型组比较,MDR3基因突变组在经1%脂肪乳诱导处理前和处理后16h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平比较差异无统计学意义,经 1%脂肪乳诱导处理 32h和 48 h MDR3 基因突变组肝细胞上清液肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、IBil、TBA)水平均明显升高(均P<0.05),确定构建MDR3 基因突变PNAC肝细胞模型脂肪酸诱导所需的时间为 32 h.与MDR3 基因突变组比较,茵陈水提物干预组肝细胞在脂肪乳处理后 32h肝细胞上清液中肝胆生化指标(ALT、AST、TBil、DBil、TBA)水平均明显降低[ALT(ng/L):148.3±2.3 比 164.9±7.0,AST(ng/L):2767.4±78.8 比 3239.4±107.1,TBil(μmol/L):7.6±0.2比13.6±0.3,DBil(μmol/L):1.8±0.1比5.7±0.2,TBA(μmol/L):3.4±0.2比6.7±0.1,均P<0.05];空白对照组、MDR3 基因野生型组、MDR3 基因突变组和茵陈水提物干预组肝细胞编码MDR3、MRP2、MRP3、MRP4 的ABCB4、ABCC2、ABCC3、ABCC4 基因mRNA表达丰度差异无统计学意义;TNF基因mRNA在MDR3基因突变组呈高表达(2-??Ct:1.258±0.200比1.001±0.052),茵陈水提物干预组呈低表达(2-??Ct:0.387±0.247 比 1.258±0.200),组间比较差异有统计学意义(P<0.05).与MDR3 基因突变组比较,茵陈水提取物干预组肝细胞编码BSEP的ABCB11 基因mRNA的表达丰度明显增高(2-??Ct:2.955±0.479 比 1.333±0.529,P<0.05).结论 茵陈水提物对MDR3 基因突变导致的PNAC有一定保护作用,可能与拮抗炎症反应,降低TNF基因的mRNA表达和改善编码BSEP的ABCB11 基因的mRNA表达有关.
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编辑人员丨2天前
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基于CRISPR技术构建发光噬菌体及其在大肠埃希菌鉴定中的应用
编辑人员丨2天前
目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体(HT7),并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg(1~10)和PFN-1000同源重组质粒菌株,并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA(sgRNA);采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)系统联合介导的基因编辑技术,将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区,并成功构建发光噬菌体HT7;通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异;此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中,sgRNA8靶标的切割效率最高,成斑效率为0.18;噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后,PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带,说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率( P<0.001)、一步生长曲线( P=0.001)、感染复数( P=0.031)的生物特性分析中,均有显著差异,裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min,最佳感染复数为0.1;临床样本测试,可识别裂解6株大肠埃希菌,其余菌株均不裂解,4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统,并成功构建发光噬菌体HT7,该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌,且对其他菌株无裂解作用,显示出良好的检测专一性和低检出限。
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编辑人员丨2天前
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CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用
编辑人员丨2天前
成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术,具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点,被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前,采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型,如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。
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编辑人员丨2天前
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克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1和2的表达影响
编辑人员丨2天前
目的:探讨克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和2(PD-L2)的表达影响。方法:纳入2018年1月至2021年1月甘肃省肿瘤医院收治的KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例,通过测序检测KRAS基因组序列,通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹检测PD-L1和PD-L2的表达。使用成簇的规则间隔的短回文重复基因编辑(CRISPR/CAS9)技术构建KRAS缺失型A549细胞,在敲除株中过表达KRAS野生型和突变型,检测其对PD-L1和PD-L2的表达影响。将KRAS野生型和突变型过表达的KRAS敲除人肺泡上皮细胞549(A549)细胞株与树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK),通过流式细胞术检测群集行列式蛋白3阳性(CD3 +)细胞的凋亡水平。使用 t检验比较连续变量。使用Mann-Whitney检验分析KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2。Chi-square检验分析非小细胞肺癌患者KRAS突变型和KRAS野生型的临床特征。 结果:纳入KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例,KRAS野生型31例、KRAS突变型64例;其中KRAS第12位甘氨酸突变为天冬氨酸(G12D)13例、突变为缬氨酸(G12V)12例、突变为半胱氨酸(G12C)25例、突变为丙氨酸(G12A)14例。KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2的mRNA表达水平(1.062比1.834, U=38;1.062比1.668, U=70;1.062比1.544, U=111;1.062比1.479, U=89, P<0.05;1.067比1.798, U=68;1.067比1.595, U=86;1.067比1.527, U=171;1.067比1.680, U=34, P<0.05)和蛋白表达水平均高于KRAS野生型患者,差异有统计学意义。在KRAS敲除A549细胞株中,相较于KRAS野生型,KRAS突变型更能够促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达同时,将KRAS-G12D,KRAS-G12V,KRAS-G12C,KRAS-G12A质粒混合在一起作为RAS野生型(KRAS-MT)与KRAS突变型(KRAS-WT)分别转染KRAS敲除A549细胞株,KRAS-MT依旧可以促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达。在KRAS敲除A549细胞株中过表达KRAS-MT与KRAS-WT后,KRAS突变亚型不能激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路,但是可以激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路。AKT抑制剂处理后,KRAS-MT与KRAS-WT转染KRAS敲除A549细胞株的PD-L1和PD-L2的表达差异无统计学意义。将转染了KRAS-MT或KRAS-WT的KRAS KO A549细胞株与DC-CIK以1∶1的比例共培养,随后检测DC-CIK细胞的凋亡水平,发现KRAS-MT能够显著增加DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡( F=12.5, P<0.05),差异有统计学意义。 结论:KRAS突变亚型能够显著增强非小细胞肺癌细胞PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达,并且能够促进免疫细胞DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡。
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编辑人员丨2天前
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利用CRISPR/Cas9技术构建人TCRP1基因敲除慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测
编辑人员丨2天前
目的:选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO,通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异,初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法:在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA),寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组,慢病毒包装系统转染293T细胞,收集纯化病毒感染K562细胞,嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆,有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO,Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株,同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL),采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果:成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体,转染293T细胞后,利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比,K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱,IM药物敏感性显著增强,细胞凋亡进程显著加快(均 P<0.05)。 结论:利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株,TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。
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编辑人员丨2天前
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应用腺相关病毒-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统基因治疗威尔森氏症的实验研究
编辑人员丨2天前
目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型,设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3,制备AAV,病毒滴度达1~4×10 13 GC/ml;感染WD肝细胞,72 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出其中活性最高者sgRNA1,构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT,应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞,测序和T7E1酶切检测模板修复效率;用HT特异性引物行PCR,验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示,sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%],与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%],差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正,能检出特异性修正后的ATP7B基因;二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。
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编辑人员丨2天前
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与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病的研究进展
编辑人员丨2天前
一些肾结石病是由单基因病所致,其中与嘌呤代谢相关的单基因病主要包括腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)缺乏症、次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HPRT)缺乏症、遗传性黄嘌呤尿症(HX)以及由PRS1、SLC22A12、SLC2A9和ABCG2等基因突变所致病症。这类疾病可导致嘌呤和尿酸代谢异常,进而形成2,8-二羟基腺嘌呤结石、尿酸结石或黄嘌呤结石等。此类疾病临床罕见,不同类型的与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病的基因型和表型有其各自特点,且不被广泛认知。目前药物治疗是此类疾病的主要治疗方法。随着基因诊断和治疗技术的进步,不断有新的致病基因和位点被发现,同时随着CRISPR/Cas9等基因编辑技术的逐步应用,与嘌呤代谢相关的单基因肾结石病在未来有望从根本上得到治愈。
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编辑人员丨2天前
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基于成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术的高迁移率族蛋白B2基因敲除巨噬细胞Raw264.7细胞株的构建与功能鉴定
编辑人员丨2天前
目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7),并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA),将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞,利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 -/- Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 -/- Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株,HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达,HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较,差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15, t=0.17, P>0.05),但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%, t=5.62, P<0.01];KP感染HMGB2 -/- Raw264.7,促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml, t=5.00, P<0.01;(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml, t=3.36, P<0.01;(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml, t=3.68, P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株,验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。
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编辑人员丨2天前
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约瑟芬结构域含蛋白2对肾透明细胞癌的增殖和迁移能力的影响
编辑人员丨2天前
目的:探讨约瑟芬结构域含蛋白2(JOSD2)的表达对肾透明细胞癌增殖与迁移的影响。方法:在Timer、UALCAN,数据库中分析JOSD2在肾癌中的差异表达和预后( P<0.05)。在Caki-1细胞系中使用成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9技术导入shRNA敲低JOSD2。设置对照组和稳定JOSD2敲低组(sh1、sh2),通过细胞计数试剂盒(CCK-8)增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验分别观察对细胞增殖、迁移能力的影响。采用独立样本 t检验进行组间比较。 结果:生信数据库发现JOSD2在多种肿瘤中异常高表达,其中包括肾透明细胞癌[28.707(22.825~36.424)比20.433(17.507~23.548), P<0.05]。在敲低JOSD2后,CCK-8结果显示,JOSD2敲低后细胞增殖能力明显低于对照组(3.11±0.08比2.12±0.13, t=14.64, P<0.05;3.10±0.08比2.18±0.20, t=10.26, P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示,JOSD2敲低后细胞集落形成能力显著低于对照组[(365.0±34.6)个比(217.0±22.0)个, t=6.948 P<0.05;(365.0±34.6)个比(186.0±38.2)个, t=7.216, P<0.05]。Transwell实验显示,JOSD2敲低后细胞迁移能力显著低于对照组[(1 234.5±85.1)个比(689.8±58.7)个, t=10.540, P<0.05;(1 234.5±85.1)个比(635.0±112.3)个, t=6.967, P<0.05]。 结论:JOSD2在肾癌中表达上调,敲低JOSD2能抑制肾癌细胞增殖和迁移。
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编辑人员丨2天前
