成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种利用RNA指导核酸内切酶进行基因编辑的技术，具有操作简便、靶向精准、周期短、基因敲除效率高等特点，被广泛用于多个物种的基因编辑及疾病基因治疗中。目前，采用该技术已构建了多种眼科疾病动物模型，如角膜营养不良模型( UBIAD1、 TGF- β R124C基因突变)、青光眼模型( MYOC Y435H、 OPTN E50K和 PMEL基因突变)、白内障模型( GJA8、 KPNA4、 c- Maf、 AQP5和 PIKFYVE基因突变)、Leber先天性黑矇动物模型( KCNJ13和 LCA5基因突变)、视网膜母细胞瘤动物模型( RB1/ RBL基因突变)和视网膜色素变性动物模型( HKDC1、 C8ORF37、 CERKL、 PRCD、 ASRGL1、 LRAT和 PDE6B基因突变)等。还有研究者采用该基因编辑技术进一步证实了 MFRP、 CPAMD8、 Pax6和 FREM基因在动物眼部发育过程中的作用。本文就CRISPR/Cas9基因编辑技术在构建眼科疾病动物模型中的应用进行综述。

目的:开发一种基于重组酶介导的等温扩增（RAA）和成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas13a）系统的幽门螺杆菌核酸检测体系。方法:选取2021—2022年于应急总医院收集的30株幽门螺杆菌以及大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌各2株。针对幽门螺杆菌UreC基因保守区序列，设计RAA-Cas13a 核酸检测体系所需的特异性引物及CRISPR RNA（crRNA）。再通过琼脂糖凝胶电泳筛选出产生非特异性产物最少的引物对，并应用Cas13a切割荧光探针产生的荧光强度筛选出切割效率最高的crRNA序列，构建了RAA-Cas13a核酸检测体系，通过检测梯度浓度稀释的幽门螺杆菌ATCC 43504基因组DNA以及5种不同的临床常见病原体基因组DNA，评价基于RAA-Cas13a核酸检测体系的最低检测限及特异性。通过RAA-Cas13a核酸检测体系与已建立的荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）方法同时检测临床菌株，得到该方法与qPCR方法的一致性。采用双侧配对 t检验对两组间的荧光值进行比较， P<0.05为差异有统计学意义。 结果:建立的RAA-Cas13a核酸检测系统可以在1 h内检测出低至10拷贝/μl的靶标DNA（ t=11.05， P<0.01），且与其他5种临床常见菌株无交叉反应。RAA-Cas13a方法与传统的qPCR方法具有良好的一致性，Kappa系数为1。 结论:建立了一种将RAA与CRISPR-Cas13a结合进行幽门螺杆菌检测的方法，可用于快速且灵敏的识别幽门螺杆菌感染。

目的:探讨克尔斯滕大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)突变亚型对非小细胞肺癌细胞程序性细胞死亡配体1(PD-L1)和2(PD-L2)的表达影响。方法:纳入2018年1月至2021年1月甘肃省肿瘤医院收治的KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例，通过测序检测KRAS基因组序列，通过实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和免疫印迹检测PD-L1和PD-L2的表达。使用成簇的规则间隔的短回文重复基因编辑(CRISPR/CAS9)技术构建KRAS缺失型A549细胞，在敲除株中过表达KRAS野生型和突变型，检测其对PD-L1和PD-L2的表达影响。将KRAS野生型和突变型过表达的KRAS敲除人肺泡上皮细胞549(A549)细胞株与树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)，通过流式细胞术检测群集行列式蛋白3阳性(CD3 +)细胞的凋亡水平。使用 t检验比较连续变量。使用Mann-Whitney检验分析KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2。Chi-square检验分析非小细胞肺癌患者KRAS突变型和KRAS野生型的临床特征。 结果:纳入KRAS阳性非小细胞肺癌患者95例，KRAS野生型31例、KRAS突变型64例；其中KRAS第12位甘氨酸突变为天冬氨酸(G12D)13例、突变为缬氨酸(G12V)12例、突变为半胱氨酸(G12C)25例、突变为丙氨酸(G12A)14例。KRAS突变型患者PD-L1和PD-L2的mRNA表达水平(1.062比1.834， U＝38；1.062比1.668， U＝70；1.062比1.544， U＝111；1.062比1.479， U＝89， P<0.05；1.067比1.798， U＝68；1.067比1.595， U＝86；1.067比1.527， U＝171；1.067比1.680， U＝34， P<0.05)和蛋白表达水平均高于KRAS野生型患者，差异有统计学意义。在KRAS敲除A549细胞株中，相较于KRAS野生型，KRAS突变型更能够促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达同时，将KRAS-G12D，KRAS-G12V，KRAS-G12C，KRAS-G12A质粒混合在一起作为RAS野生型(KRAS-MT)与KRAS突变型(KRAS-WT)分别转染KRAS敲除A549细胞株，KRAS-MT依旧可以促进PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达。在KRAS敲除A549细胞株中过表达KRAS-MT与KRAS-WT后，KRAS突变亚型不能激活细胞外信号调节激酶(ERK)通路，但是可以激活丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(AKT)通路。AKT抑制剂处理后，KRAS-MT与KRAS-WT转染KRAS敲除A549细胞株的PD-L1和PD-L2的表达差异无统计学意义。将转染了KRAS-MT或KRAS-WT的KRAS KO A549细胞株与DC-CIK以1∶1的比例共培养，随后检测DC-CIK细胞的凋亡水平，发现KRAS-MT能够显著增加DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡( F＝12.5， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:KRAS突变亚型能够显著增强非小细胞肺癌细胞PD-1配体PD-L1和PD-L2的表达，并且能够促进免疫细胞DC-CIK细胞中CD3 +细胞亚群的凋亡。

目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

虽然目前诊断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的金标准，即实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于人群筛查并且检测限可低至1拷贝/μl，但最新的病毒动力学模型表明，相较于灵敏度而言，高频率检测和快速诊断才是减少病毒传播的关键。因此，研究人员正努力探索基于CRISPR-Cas技术的病毒RNA检测新策略。其中，Cas13a蛋白可与CRISPR RNA(crRNA)形成复合物并在crRNA的引导下靶向结合目的RNA序列，激活核酸酶活性，非特异地切割附近的任意单链RNA。利用这一特性，将带有荧光淬灭基团的RNA探针加入体系，可检测靶RNA序列。在此原理上，本研究开发了一种突破性方法，无需前期预扩增即可直接从鼻拭子RNA中检测SARS-CoV-2。通过设计针对病毒N基因和E基因的不同区域的多个crRNA，等浓度组合加入反应体系，使单次反应可以激活更多的Cas13a蛋白，检测灵敏度提高的同时也减少了基因突变导致检测脱靶的可能性，整个检测过程均在样品中直接进行，无需额外操作。此外，该新型检测平台还可以将反应速率和产生的荧光信号转化为病毒载量，样本定性的同时进行RNA定量。为了提高检测的简单性和便携性，本研究还设计了一个小型设备包括低成本的激光照明和光收集元件，可以通过手机摄像头读取CRISPR-Cas13a检测产生的荧光信号，灵敏度达到100拷贝/μl的同时能够在5 min内准确诊断出一组从新型冠状病毒肺炎患者样本中预提取的RNA。本研究开发的方法有可能为现场SARS-CoV-2筛查提供一种快速、准确、便携和低成本的选择。

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)LOC101927476在卵巢癌细胞中的表达及其对卵巢癌生物学特征的影响。方法:选取2018—2019年于中国医学科学院肿瘤医院手术治疗的卵巢癌患者。采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测卵巢癌细胞系3AO、OVCA429、TOV21G、A2780、SKOV3以及22例卵巢癌原发瘤和转移瘤组织中LncRNA LOC101927476的表达水平，采用TCGA数据库中卵巢癌转录组测序数据验证LncRNA LOC101927476和GATA4的表达，采用慢病毒包装体系构建过表达LOC101927476(OE-LOC101927476组)和空载(OE-EV组)慢病毒并转染至3AO细胞。设计单链向导RNA(sgRNA)，利用CRISPR/Cas9构建LncRNA LOC101927476敲除细胞系。采用Transwell法和划痕实验检测LncRNA LOC101927476对卵巢癌细胞侵袭和转移能力的影响。采用细胞计数盒8(CCK-8)法检测细胞的增殖能力。结果:real-time PCR显示，22例卵巢癌患者中，20例转移灶中LncRNA LOC101927476的表达水平低于原发灶。Transwell迁移实验显示，OE-EV组3AO细胞的穿膜细胞数为(1 024±76)个，高于OE-LOC101927476组[(699±65)个， P＝0.003]；sg-Control组OVCA429细胞的穿膜细胞数为(363±27)个，低于sg-LOC101927476组[(472±40)个] ，差异有统计学意义( P＝0.011)。Transwell侵袭实验显示，OE-EV组3AO细胞的穿膜细胞数为(661±95)个，高于OE-LOC101927476组[(357±63)个]，差异有统计学意义( P＝0.006)；sg-Control组OVCA429细胞的穿膜细胞数为(309±13)个，低于sg-LOC101927476组[(512±72)个] ，差异有统计学意义( P＝0.005)。划痕实验显示，培养48 h时，OE-LOC101927476组3AO细胞的划痕愈合比例为(10.86±0.63)%，低于OE-EV组[(57.38±4.42)%]，差异有统计学意义( P＝0.009)；培养24 h时，sg-LOC101927476组OVCA429细胞的划痕愈合比例为(59.98±1.34)%，高于sg-Control组[(23.15±2.03)%]，差异有统计学意义( P＝0.004)。CCK-8结果显示，OE-LOC101927476组3AO细胞的增殖能力明显减弱，在过表达LncRNA LOC101927476后第4天时，OE-LOC101927476组3AO细胞的吸光度( A)值为2.07±0.08，与OE-EV组(2.29±0.04)比较，差异有统计学意义( P＝0.009)。sg-LOC101927476组OVCA429细胞的增殖能力提高，在敲降LncRNA LOC101927476的表达后第4天时，sg-LOC101927476组OVCA429细胞的 A值为(2.13±0.03)，与sg-Control组(1.93±0.03)比较，差异有统计学意义( P＝0.001)。OE-LOC101927476组3AO细胞中GATA4的相对表达水平为1.86±0.25，与OE-EV组(1.00±0.00)比较，差异有统计学意义( P＝0.001)。在LncRNA LOC101927476高表达的患者中，GATA4的表达水平为(2.93±0.35)，高于LncRNA LOC101927476低表达的患者(0.29±0.06)，差异有统计学意义( P＝0.001)。 结论:LncRNA LOC101927476能够抑制卵巢癌的侵袭、迁移和增殖。

目的:初步探索ras相关C3肉毒杆菌毒素底物3（RAC3）在1型糖尿病（T1DM）和树突状细胞（DC）中的作用。方法:选取来自广东省T1DM转化医学研究中2011至2016年入组后规律随访的T1DM患者作为病例组，选择2011至2016年来自中山大学附属第三医院就诊的正常糖耐量者作为健康对照组。病例组和对照组均在筛选阶段进行全外显子组测序，在验证阶段进行基因分型。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建C57BL/6小鼠背景的RAC3全身敲除（KO）小鼠模型。使用聚合酶链反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blotting法分别验证RAC3在DNA、RNA和蛋白水平是否被敲除。通过流式细胞染色检测RAC3 KO小鼠和同窝野生对照（WT）小鼠（每组3只）的DC分化比例以及主要组织相容性复合体Ⅱ类分子（MHC Ⅱ）、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平。采用logistic回归分析法比较病例组和对照组之间等位基因频率分布的差异。组间比较采用独立样本 t检验。 结果:筛选阶段共纳入72例T1DM患者和487名健康对照，验证阶段共纳入122例T1DM患者和577名健康对照。筛选阶段结果显示，T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照［分别为7.64%（11/144）和1.13%（11/974），OR=9.38， P<0.001］。验证阶段基因分型结果同样显示，T1DM患者中RAC3 rs4969478位点的等位基因T频率高于健康对照［分别为4.50%（11/244）和1.13%（13/1 154），OR=4.14， P<0.01］。WT小鼠和RAC3 KO小鼠的DC分化比例差异无统计学意义（分别为85.6%±1.1%和83.3%±0.25%， P=0.08）。WT小鼠和RAC3 KO小鼠DC中MHC Ⅱ、CD86和CD80等成熟活化指标的表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）。 结论:遗传学研究提示RAC3可能是人类T1DM的易感基因，但可能不通过DC参与T1DM的发生。

利用在原核生物中观察到的规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）与相关的Cas（CRISPR- associated proteins）蛋白构成CRISPR-Cas系统作为真核细胞中的基因编辑工具为近年研究热点。效应蛋白由多个Cas蛋白组成，包括两个大类五型系统。Cas蛋白结合特定的核酸序列，具有核酸酶的功能用于可编程基因组编辑和表观遗传调控，同时在疾病诊断方面也有很好的发展前景。其中Cas6是一种独立于金属的单转位酶，依附在crRNA裂解产物上，可识别并在crRNA转录前的重复序列中裂解单个磷酸二酯键。核糖核酸内切酶Cas9为RNA引导的DNA裂解酶，是目前应用最广泛的基因编辑工具，同时在感染性疾病检测、癌性病毒感染的消除或灭活、肿瘤免疫治疗、肿瘤基因组和表观基因组的调控等方面显示出巨大的应用前景。RNA引导的核酸内切酶Cas12a具有两种不同的核酸酶活性，且该双重催化活性已被用于多重基因编辑。Cas12a的显著特性使其应用于目标DNA与RNA快速检测，成为CRISPR-Cas基因组编辑工具包的补充。RNA引导的RNA靶向核酸内切酶Cas13a是RNA引导、RNA激活的RNA酶，已被开发为RNA检测、RNA成像和RNA调控的强大工具，同时利用Cas13a构建高灵敏度及特异度的检测方法也可为感染性疾病在诊断过程中提供重要的理论依据。由此展开对CRISPR-Cas系统相关的Cas蛋白的深入研究，同时对上述系统在不同疾病中的重要应用等进行阐述，有助于为各项研究提供新思路，新方法。

目的:基于规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的特异性识别切割与非特异性的“反式切割”活性，建立易操作、检测限低、特异性好的核酸免扩增可视化快速检测方法—基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增快速检测技术。方法:参照新型冠状病毒的基因序列，利用生信技术筛选并设计合成多个新型冠状病毒特异的crRNA（CRISPR RNA），以体外转录的通用ssRNA（单链RNA）靶标建立检测技术并优化检测体系，以新型冠状病毒假病毒核酸标准物来评价方法检测限。收集临床样本，其中阳性样本应包含不同的新型冠状病毒变异株，阴性样本包括其他的常见呼吸道病原体（甲型流感病毒/乙型流感病毒、人类副流感病毒、肺炎克雷伯菌等）临床样本。分别用实时荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR及本研究建立的免扩增可视化快速检测技术，对各种样本进行检测，分析评价新建立技术的灵敏度和特异度。采用四格表确切概率法针对荧光定量PCR、数字PCR与本技术检测结果进行统计学分析，采用双侧检验， P<0.01为差异有统计学意义。 结果:本研究设计合成了10条crRNA，用于基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术的建立与优化，本技术可在最短6 min内检出新型冠状病毒的核酸。利用新型冠状病毒假病毒核酸标准物评价该技术的检测限，结果显示仪器辅助下本技术检测限为14拷贝/μl，肉眼下检测限为28拷贝/μl。以qPCR和数字PCR确认的113份临床样本对所建立的检测技术进行敏感度和特异度分析，利用相关公式及SPSS22软件计算分析，该检测技术的敏感度98.5%（66/67），特异度100%（46/46），本研究建立的基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒免扩增可视化快速检测技术检测结果与金标准qPCR检测结果差异无统计学意义（ P=1）。 结论:本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas13a的新型冠状病毒核酸免扩增可视化快速检测技术，该技术流程简单、操作便捷，对操作环境要求低，检测限接近qPCR，有较强的现场检测应用潜力。

目的:基于重组酶介导的扩增技术(recombinase aided amplification，RAA)和CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)检测，建立一种快速、灵敏且特异的重要境外输入性病毒检测方法。方法:以流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、黄热病毒(Yellow fever virus，YEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)、裂谷热病毒(Rift Valley fever virus，RVFV)、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)为检测对象，设计特异性RAA扩增引物和CRISPR RNA(crRNA)，建立RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测反应，评价方法的灵敏度和特异性，使用登革热疑似临床样本进行检测，并与荧光RT-PCR技术进行比较，同时检测其余7种病毒临床模拟样本。结果:RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能在39 ℃条件下，40~52 min内检测出8种输入性传染病病原体，灵敏度达到1~10拷贝/μl，并且这8种病原体之间无交叉反应，临床样本均可100%检测出。结论:建立的RAA扩增结合CRISPR-Cas13a蛋白检测方法能够灵敏、特异且快速地检测出8种境外输入性传染病病原体。