目的 探索DIRAS3对胶质瘤患者预后的影响及其潜在机制.方法 通过TCGA和CGGA数据库提取DIRAS3表达谱和临床数据,分析DIRAS3在不同临床病理特征胶质瘤患者中mRNA的表达水平,及其对总生存期和临床病理特征的影响.收集32例包括正常脑及胶质瘤组织标本,并采用Western blotting、免疫组织化学等方法比较DIRAS3蛋白在不同等级胶质瘤和正常组织中的表达差异.通过基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因集富集分析(GSEA)和基因集变异分析(GSVA)等方法,对DIRAS3及其共表达基因可能的生物学功能和信号传导通路进行分析.并分析DIRAS3与免疫细胞浸润程度以及免疫相关分子表达之间的关系.结果 DIRAS3在胶质瘤中的过表达现象明显,且其表达水平随WHO分级升高而增加,并与患者的总生存率呈负相关.生物信息学分析显示,DIRAS3的高表达与患者年龄、肿瘤分级、IDH状态以及1p/19q编码缺失有关.此外,DIRAS3相关表达基因富集在多种免疫相关通路中,参与调节免疫反应的多个过程.结论 DIRAS3不仅是胶质瘤的诊断和预后生物标志物,更是胶质瘤免疫疗法的关键靶点.

目的:构建自噬基因表达特征的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者预后的预测模型。方法:从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)、基因型-组织表达研究项目(The Genotype-Tissue Expression, GTEx)数据库中分别得到所有HCC和正常肝细胞组织的基因转录表达数据，并将每个样本的基因转录表达数据统一转化为log 2(FPKM值＋1)，消除数据库之间测试平台的数据差异。根据人类自噬基因库中获取的人类自噬基因列表筛选出TCGA-GTEx整合后序列中每个样本对应的自噬基因的表达量。采用R语言limma包以错误发现率( FDR)<0.05及差异倍数|logFC|>1为筛选标准，进行自噬基因差异表达分析。采用R语言clusterProfiler包对差异表达自噬基因以 P<0.05为筛选标准，进行基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)富集分析。根据自噬基因的差异表达量和患者的临床信息，采用R语言survival包进行单因素的Cox回归分析。进一步将单因素的Cox回归分析中有统计学意义( P<0.05)的自噬基因纳入到多因素Cox回归分析中，以每个差异表达的自噬基因表达量和相对应的回归系数 coef值为基础，构建HCC的自噬基因预后模型：expmRNA1×βmRNA1＋expmRNA2×βmRNA2＋…＋expmRNAn×βmRNAn(exp：基因表达量；β：多因素Cox回归分析的回归系数 coef)。绘制预测模型的受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线并计算ROC曲线下面积(area under curve，AUC)评估模型预测价值。 结果:从TCGA-GTEx数据库中共得到HCC样本374例和正常肝组织样本160例的基因转录表达数据及临床信息。从整合后的样本序列中共筛选出205个自噬基因的表达数据，其中SPNS1、DIRAS3、TMEM74、NRG2、NRG1、IRGM、IKBKE、NKX2-3、BIRC5、CDKN2A、TP73为符合筛选标准的差异表达自噬基因。差异表达自噬基因GO主要富集在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的调控、ErbB 2信号通路、蛋白激酶调节活性、激酶调节活性等功能。差异表达自噬基因主要富集在EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、Hippo信号通路等KEGG通路。整合并删除生存信息缺失的样本后，共418例样本表达纳入到Cox回归分析中。通过单因素、多因素Cox风险回归分析后，筛选出NRG1( HR＝1.5565，95% CI：1.1793～2.0543)、IKBKE( HR＝1.7502, 95% CI：1.2093～2.5330)这两个自噬基因并建立预后预测模型：(0.44247×NRG1的表达量)＋(0.55977×IKBKE的表达量)。预测模型的ROC曲线显示7年总体生存的AUC为0.711。 结论:基于NRG1和IKBKE表达量构建的HCC预后模型，对HCC患者远期生存率有较高的预测价值。

2024年4月3日,浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所/浙江大学转化医学研究院孙毅教授团队在《发育细胞》(Developmental Cell)杂志上发表了最新研究成果论文"The UBE2F-CRL5ASB11-DIRAS2 axis is an oncogene and tumor suppressor cascade in pancreatic cancer cells"(DOI:10.1016/j.devcel.2024.03.018),该研究发现拟素化耦联酶Ube2f在KrasG12D诱导的胰腺肿瘤发生过程中起着重要的协同作用,是一个靶向胰腺癌的潜在靶点.

目的:探讨miR-105-5p在胃癌(GC)中的表达情况、临床意义及生物学功能及其潜在的作用机制.方法:应用real-time PCR检测miR-105-5p在GC组织与癌旁组织以及不同GC细胞(MGC-803,MKN-1,SGC-7901,BGC-823和AGS)与正常胃黏膜细胞(GES-1)中的表达;分析miR-105-5p的表达与GC临床病理特征及患者预后的关系;采用Transwell迁移和侵袭实验以及MTT实验检测miR-105-5p对GC细胞迁移与侵袭能力以及增殖能力的影响;应用生物信息学工具预测miR-105-5p的下游靶点,并应用荧光素酶报告实验以及Western blot分析miR-105-5p对靶点的调节作用.结果:miR-105-5p在GC组织的表达明显高于癌旁组织,在各GC细胞中的表达均明显高于正常胃黏膜细胞(均P＜0.05).miR-105-5p的表达水平与肿瘤大小(P=0.020)和远处转移(P=0.004)明显有关;miR-105-5p低表达GC患者的总体生存率明显高于miR-105-5p高表达组的患者(P=0.001 8).选择miR-105-5p表达量相对较低的BGC-823细胞和相对较高的MKN-1细胞,分别转染miR-105-5p模拟物和miR-105-5p抑制物,转染后结果显示,BGC-823细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显增强,而MKN-1细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显抑制(均P＜0.05).生物信息学分析发现,DIRAS家族GTP结合RAS样3(DIRAS3)可能是miR-105-5p的作用靶点;荧光素酶报告实验显示,miR-105-5p能够负向调节DIRAS3-3'UTR的荧光素酶活性;Western blot显示,转染miR-105-5p模拟物的BGC-823细胞中DIRAS3的表达明显下调,转染miR-105-5p抑制物的MKN-1细胞DIRAS3的表达明显上调(均P＜0.05).结论:miR-105-5p在GC中表达升高,其可能通过靶向作用于DIRAS3增强GC细胞的迁移、侵袭及增殖,进而促进GC的发生发展.

目的 探讨长链非编码RNA LINC00662对miR-409-5p表达的调控作用及对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响.方法 荧光实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测宫颈癌组织、宫颈癌细胞系中LINC00662的表达.转染载有LINC00662的质粒或阴性对照质粒至LINC00662表达最低的细胞系.细胞计数(CCK-8)法和Transwell侵袭实验分别检测高表达LINC00662对细胞侵袭能力的影响.采用生物信息学技术预测LINC00662的下游基因,qPCR检测miR-409-5p和DIRAS3 mRNA的表达量,Western Blot检测DIRAS3蛋白的表达量.结果 LINC00662在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中表达明显减少(P<0.05).高表达LINC00662明显抑制宫颈癌HCC94细胞的增殖能力(P<0.05)和侵袭能力(P<0.01).生物信息学技术显示LINC00662可靶向结合miR-409-5p,miR-409-5p可靶向结合DIRAS家族GTP酶3(DIRAS family GTPase 3,DIRAS3)基因.高表达LINC00662后,miR-409-5p表达减少(P<0.01),DIRAS3在mRNA和蛋白水平的表达均增加(P<0.01).结论 LINC00662在宫颈癌组织和细胞系呈低表达,高表达LINC00662可通过影响miR-409-5p的表达抑制宫颈癌HCC94细胞的增殖和侵袭,在宫颈癌中表现为抑癌基因的功能.

目的 建立基于大规模自噬相关基因的luminal型乳腺癌预后预测模型.方法 利用TCGA数据库乳腺癌数据,分别筛选luminal型与非luminal型乳腺癌、癌旁组织中差异表达的自噬相关基因.单因素和多因素Cox回归建立luminal型乳腺癌自噬相关基因预后模型.Kaplan-Meier曲线和生存依赖的受试者工作特征曲线评估预后模型的准确性.结果 基于差异表达自噬相关基因,建立了一个3基因(BAG1、CD46、DIRAS3)预后模型预测luminal型乳腺癌患者总生存期.3年、5年和10年的曲线下面积分别为0.708、0.752和0.837.结论 3基因预后模型可以有效预测luminal型乳腺癌患者预后,或许今后可为luminal型乳腺癌的临床治疗提供决策依据.

目的 了解甲状腺干扰物马拉硫磷处理人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞后,DIRAS1和APOL3蛋白表达的变化,探讨马拉硫磷干扰Nthy-ori-3-1细胞功能的可能机制.方法 以0、0.5、1、2和5μg/ml的马拉硫磷作用于Nthy-ori-3-1细胞,以MTT法测定细胞存活率,倒置荧光显微镜观察细胞生长状态、细胞形态,在无细胞毒性剂量下,采用Western blot检测DIRAS1和APOL3蛋白表达的变化.结果 5μg/ml的马拉硫磷对甲状腺Nthy-ori-3-1细胞有毒性作用(P<0.05);1、2μg/ml马拉硫磷处理Nthy-ori-3-1细胞后,提高了DIRAS1和APOL3蛋白的表达(P<0.05),0、0.5μg/ml马拉硫磷对蛋白表达没有影响.结论 一定剂量甲状腺干扰物马拉硫磷可干扰人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞DIRAS1和APOL3蛋白的表达.

目的 探讨RAS相关细胞生长抑制因子(DIRAS1)基因启动子区在胰腺癌中的甲基化情况及其表达调控机制.方法 应用RT-PCR和甲基化特异性PCR(MSP)技术探索和验证8个胰腺癌细胞系中DIRAS1基因的表达与启动子区的甲基化情况的关系.应用MSP技术检测DIRAS1基因在胰腺癌组织中的表达情况.采用 χ2检验分析DIRAS1甲基化率与胰腺癌患病相关因素的关系.结果 DIRAS1基因在Panc1、Miapaca2细胞中高表达,MSP结果表明其启动子区域呈非甲基化状态;在Panc3.11、T3m4细胞中表达下调,其启动子区呈部分甲基化状态;在Sw1990、Panc10.05、Bxpc3和Aspc1细胞中DIRAS1表达缺失,其启动子区呈完全甲基化.这些结果表明,DIRAS1基因启动子区域甲基化与其表达水平密切相关.应用去甲基化药物5-aza-dc处理这些细胞系后发现,非甲基化的细胞(Panc1、Miapaca2)中DIRAS1表达水平无改变,部分甲基化的细胞(Panc3.11、T3m4)中其表达水平升高,完全甲基化的细胞(Sw1990、Panc10.05、Bxpc3、Aspc1)中恢复其表达,结果表明DIRAS1的表达受启动子区甲基化调控.在原发性胰腺癌组织中,DIRAS1的甲基化率为51.8％(43/83),DIRAS1甲基化与肿瘤的分化程度相关(P=0.01),而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、神经侵犯、淋巴结转移、吸烟、饮酒等因素无关(P均>0.05).结论 DIRAS1在胰腺癌中频繁发生甲基化,其表达受启动子区甲基化调节.DIRAS1甲基化是胰腺癌预后不良的标志.

目的 分析自噬相关基因在膀胱癌中表达模式并基于自噬相关基因构建膀胱癌预后模型.方法 基于癌症基因组图谱数据库中膀胱癌患者基因表达谱数据和临床相关信息,分析自噬相关基因在膀胱癌中的表达模式;利用单因素、多因素Cox回归模型,筛选同膀胱癌预后相关的自噬相关差异表达基因,建立预后风险模型;利用不同来源的数据集(GSE48075)评估建立的预后风险模型.结果 共筛选出38个膀胱癌组织中差异表达的自噬相关基因,MYC,SPHK1、NAMPT、P4HB、SPNS1、DIRAS3、TP63、APOL1、ITGA3等自噬相关基因表达同膀胱癌预后相关,利用MYC、SPHK1、NAMPT等自噬相关基因成功构建了膀胱癌预后风险模型,风险模型验证结果表明该模型对膀胱癌预后有较好的预测效果,表现为预后模型低风险组预后良好,高风险组预后较差.结论 膀胱癌风险预后模型可较好地预测膀胱癌患者生存情况.

目的 研究口腔癌前病变细胞中尼古丁诱导α3nAChR和α7nAChR表达及与Prx1的相互作用,探讨尼古丁在口腔癌前病变中的作用机制.方法 利用Discovery Studio 2016软件预测α3nAChR和α7nAChR与Prx1是否存在直接结合,在体外培养的口腔癌前病变DOK细胞中进行验证.细胞分为尼古丁组(1μmol/L尼古丁处理7 d)和对照组(无任何处理),利用Co-IP和Western Blot检测细胞中Prx1与α3nAChR或α7nAChR的结合.采用 α-BTX阻断α7nAChR受体,Western Blot检测尼古丁诱导Prx1结合蛋白GTPBP4和DIRAS2的表达.结果 尼古丁可诱导DOK细胞α3nAChR、α7nAChR、Prx1及其结合蛋白GTPBP4和DIRAS2表达增高.软件预测α3nAChR和α7nAChR均可能通过氢键和疏水键与Prx1直接结合,但是在DOK细胞中未检测到Prx1与α3nAChR或α7nAChR的结合.α-BTX特异性阻断α7nAChR对DOK细胞中GTPBP4和DIRAS2的蛋白水平无明显影响(P>0.05).结论 尼古丁可诱导口腔癌前病变细胞α3nAChR、α7nAChR、Prx1及其结合蛋白GTPBP4和DIRAS2表达增高;α7nAChR对Prx1的调控并非通过两者直接结合发挥作用,且亦非通过GTPBP4、DIRAS2介导完成.