目的:探讨Y染色体无精子症因子（azoospermia factor，AZF）微缺失拓展检测方法在遗传性不育和性发育异常疾病中的应用价值。方法:本研究分别运用多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）结合琼脂糖凝胶电泳方法、复合荧光多重PCR毛细管电泳DNA片段分析技术以及染色体核型分析技术对2020年3月就诊于河南省人民医院生殖中心的1例不育症患者（患者1）和2020年4月就诊于河南省人民医院内分泌科的1例性腺发育异常儿童（患者2）进行检测。结果:针对15个序列标签位点（sequence tagged site，STS）对这2例患者进行检测，结果未提示Y染色体AZF微缺失；针对27个STS遗传标记进行拓展检测，结果检测提示患者1位于X染色体长臂的STS位点扩增峰值是X染色体短臂扩增峰值的近3倍（Xqp），X染色体长臂的STR质控位点扩增峰为2个峰，且比值约为2∶1（GATA31E08和DXS6809），TAF9b位点在X染色体长臂扩增峰值与常染色体扩增峰值的比值约为3∶2，该患者X染色体长臂可能存在拷贝数异常。患者2，C03Yp、TAF9b、C01Yq和C11Xp位点在X染色体或Y染色体的扩增峰值与常染色体扩增峰值比值约为1∶1，X染色体的STR质控位点扩增峰为2个峰，且比值约为1∶1（GATA31E08和DXS6795），该患者可能存在X和Y染色体拷贝数异常；染色体核型分析显示患者1染色体核型为47，XY，i（X）（q10）；患者2染色体核型为48，XXYY，与AZF微缺失拓展检测结果相印证。结论:与传统AZF检测方法相比，本拓展检测方法不仅可以满足AZF检测需要，还可以提示性染色体拷贝数异常，较染色体核型分析技术，具有操作简捷的特点，可减低临床检验成本及工作量。

目的 研究不同生长年限巴戟天Morinda officinalis根部蒽醌类化合物的含量差异及生物合成相关基因.方法 采用HPLC测定1年生和6年生巴戟天根中蒽醌类化合物成分,并进行比较转录组分析,采用qRT-PCR验证基因表达结果.结果 HPLC检测结果显示在6年生根中蒽醌类物质显著增加,通过比较转录组分析,从1年生和6年生巴戟天的根中筛选到8619条差异表达基因,KEGG分析表明差异基因主要富集在各种次生代谢物的生物合成、苯丙素生物合成、泛醌和其他萜类醌生物合成等通路中.此外,共鉴定到13条蒽醌生物合成途径相关的差异表达Unigenes,其中ICS、SK、CS、DHNA-CoA synthase均在6年生根中上调表达,而 DXS、DXR、DAHPS、IDH均下调表达,DHQD/SDH既有上调表达的又有下调表达的Unigenes.进一步选择6个候选基因进行qRT-PCR验证,验证结果与转录组数据一致.结论 为鉴别参与巴戟天蒽醌生物合成的相关基因提供参考,为后期进一步深入研究蒽醌类生物合成的累积规律分子机制提供基础数据.

[目的]为了探究草珊瑚[Sarcandra glabra(thunb)nakai]不同器官中内源激素对类胡萝卜素差异积累的可能调控机制.[方法]通过代谢组学方法分析草珊瑚中内源激素和类胡萝卜素代谢物在不同器官间的差异分布情况,结合转录组学技术挖掘草珊瑚类胡萝卜素相关差异酶基因,进一步预测参与调控差异酶基因的转录因子及其激素相关顺式响应元件,从而分析内源激素对类胡萝卜素差异积累的可能调控作用.[结果]吲哚-3-羧酸(indole-3-carboxylic acid)、反式茉莉酸[(-)-jasmonic acid]、二氢茉莉酮酸甲酯(ethyl dihydrojasmonate)、油菜素甾酮(castasterone)、油菜素内酯(brassinolide)等 7 种内源激素在叶中的含量更高,与角黄素(canthaxanthin)、海胆酮(echinenone)、新黄质(neoxanthin)和念珠藻黄素(nostoxanthin)等 8 种差异代谢物等富集部位一致;而脱落酸(abscisic acid,ABA)、赤霉素 4,5-甲氧基水杨酸(gibberellin 4,5-methoxysalicylic acid)、二氢茉莉酸(dihydrojasmonic acid)和 5,6-二羟基吲哚(5,6-dihydroxyindole)在根中的含量更高,与脱落酸醛(abscisic aldehyde)、4,4'-二聚戊烯(4,4'-aiapolycopenedial)、花药黄质(antheraxanthin)这 3 种差异代谢物富集部位一致;关键转录因子MYB106、SPL1、NAC015、ERF064、WRKY44、BHLH116 可通过响应AUX、SA、GA、ABA、Me_JA等植物激素的刺激,参与调控类胡萝卜素合成途径的DXS、VDE、ABA2、AOG、ZEP、CYP97C1、DWARF27、CRTISO、LCYB、PSY这 10 种代谢酶的表达.实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)结果表明,随机选取的 8 个差异基因表达趋势与转录组测序结果一致.[结论]筛选出草珊瑚叶和根与类胡萝卜素相关的 15 种差异内源激素与 11 种差异代谢物,预测了 6 种转录因子参与调控 10 种代谢酶.

1-脱氧-D-木桐糖-5-磷酸合酶(DXS)是萜类化合物生物合成途径——甲基赤藓糖醇磷酸途径(MEP)中的一种必需酶.该酶是催化MEP途径的第一步反应,能够使丙酮酸和甘油醛 3-磷酸缩合形成1-脱氧-D-酮糖-5-磷酸(DXP).枯草芽孢杆菌遗传背景清晰,是一种优良的潜在萜类化合物生产菌.然而,关于枯草芽孢杆菌MEP途径关键酶DXS的研究仍不完善.本次研究克隆了枯草芽孢杆菌的dxs基因,构建了该基因的重组表达质粒,并将其转入枯草芽孢杆菌中进行过表达,分析DXS对枯草芽孢杆菌代谢途径的影响.结果表明,dxs基因的过表达能够引起枯草芽孢杆菌代谢途径异常,导致二氧化碳排放量增加.

对吐鲁番地区核心葡萄品种资源的香味性状进行综合评价研究,为葡萄香味品种选育提供可靠数据,以提高育种效率.以27份葡萄品种资源为试验材料,通过果实香味表型鉴定、萜类物质测定、主要萜类物质调控基因位点分型测定研究,对资源进行综合鉴定,研究品种间的香味性状差异,筛选优异香味育种材料.27份品种表现草莓香、无香、玫瑰香、混合香等4种香型.共检测到26种萜类物质,在4种香型品种中均有分布,但在物质种类和含量上存在显著差异,玫瑰香型品种的萜类物质种类和含量高于草莓香型和无香型品种;玫瑰香型品种间也存在显著差异,香味浓郁品种的萜类物质种类和含量高于香味清淡品种;混合香型品种的橙花醇、香茅醇、玫瑰醚含量高于其他3种香型品种的平均含量.里那醇、香叶醇、橙花醇、香茅醇、玫瑰醚等为玫瑰香型品种的主要萜类物质.27份品种的主要萜类物质调控基因位点基因型表现为显性纯合型T/T、显性杂合型G/T、隐性纯合型G/G.阳光玫瑰和早康宝为T/T型,无核白、红地球、巨峰、白香蕉、无核白鸡心、SP1153为G/G型,其他品种均为G/T型.研究认为阳光玫瑰、早康宝是理想的玫瑰香味育种材料,早收麝香、香妃、贵妃玫瑰、意大利、绿洲宝石、无核翠宝等品种具有浓郁或较浓郁的玫瑰香味且携带香味显性杂合基因G/T,可以考虑用作育种材料,通过自交或品种间杂交,选育香味品种,将能提高育种效率.葡萄DXS基因KASPSNP分型检测是鉴定玫瑰香型品种或杂交后代单株的有效手段.

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是MEP萜类合成途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成过程中发挥重要的作用.以福鼎大白茶为实验材料,在课题组前期转录组数据的基础上,运用RT-PCR技术克隆了茶树CsDXS1基因的完整开放阅读框(ORF).该ORF长度为2154 bp,编码717个氨基酸.生物信息学分析结果表明,茶树CsDXS1蛋白与其他植物的同源蛋白相似性高达85％-90％,属于DXS基因家族的I类基因,该蛋白是不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,有15个可信度高的磷酸化位点,具有典型的转酮醇酶亚家族功能域.利用实时荧光定量PCR对CsDXS1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,CsDXS1基因的表达水平在第三叶中最高,嫩叶中的表达量显著高于茎和老叶,表达水平从高到低依次为第三叶>第四叶>第二叶>第一叶>嫩茎>老茎>老叶.在不同激素处理中,CsDXS1的表达量受到不同程度的诱导,且表达量峰值的出现时间存在差异.CsDXS1在IAA和ABA激素处理下的表达量峰值最高(4 h),均为对照的1.5倍,在MeJA处理下表达量峰值最低(24 h),仅为对照的1.1倍.

目的:分析从2个血友病A家系中检出的2个未报道的内含子突变对剪接的影响,明确这2种突变的致病性,为遗传咨询提供依据.方法:通过检测相关的凝血指标,明确血友病A的诊断.进行F8相关检测,包括PCR扩增及测序分析F8的26个外显子及其侧翼序列、拷贝数检测、内含子1和内含子22倒位检测,明确致病突变.采用巢式PCR扩增外周血中的mRNA,从异位转录水平分析内含子突变对剪接的影响.针对6个短串联重复序列(short tandem repeats,STR)位点F8Up226、F8Up146、F8Int13、F8Int25、F8Down48和DXS1073进行家系遗传连锁分析,用SNaPshot SNP分型技术检测外周血、口腔黏膜细胞和毛囊细胞嵌合情况,分析突变来源.结果:家系1中血友病A先证者1的FⅧ:C为0.9％,检测到F8的9号内含子c.1444-2dupA突变,mRNA分析显示该突变导致F8的10号和11号外显子缺失;家系2中血友病A先证者2的FⅧ:C为5.1％,检测到F8的18号内含子c.5999-29T＞G突变,mRNA分析显示该突变产生2种转录本,即缺失19号外显子的异常转录本和少量正常转录本.家系1无血友病A家族史,遗传分析显示突变来源于先证者的外公,但外公的血液、毛发和口腔样本嵌合检测均未检出突变.结论:c.1444-2dupA和c.5999-29T＞G突变均为国际首次报道,突变导致了不同程度的剪接异常,分别引起重型和轻型血友病A.家系1的c.1444-2dupA为新发突变,可能是在先证者外公的精子形成过程中发生.

以东方百合‘演员’花瓣为试验材料,采用RACE技术,克隆得到百合1脱氧木酮糖5-磷酸合成酶基因DXS的cDNA全长,命名为LeDXS(GenBank登录号为MF576067).序列分析表明,LeDXS基因cDNA序列全长2 471 bp,其中开放阅读框包含2 142 bp,编码713个氨基酸,相对分子量大小约为76.3 kD,等电点为6.65,化学式为C3370H5374N942O1016S32.系统进化分析结果显示,LeDXS与猕猴桃和万寿菊DXS聚为一类,属于Ⅰ型DXS,是功能较保守的一类.实时荧光定量PCR结果分析表明,LeDXS基因在不同品种百合花瓣中均有表达,且浓香型百合DXS基因表达量比淡香型和无香型百合高.该研究结果为百合DXS生物学功能研究奠定了基础,同时也为百合花香育种提供了理论依据.

萜类物质是自然界中广泛存在的一类天然化合物,对植物、动物和人类都有重要价值.1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)对萜类物质合成调控起关键作用,是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个酶,也是该途径的一个限速酶,亚细胞定位于类囊体中,具有质体转运肽序列和3个功能结构域:TPP结合结构域、转酮醇酶结构域和嘧啶结合结构域,可用高效液相色谱法测定其活性.目前已从178种植物中克隆分离到DXS基因,按蛋白同源性可分为3类:DXS1、DXS2和DXS3.DXS基因表达具有组织特异性、昼夜节律性,与花朵、果实发育程度和品种有关.转外源或内源DXS基因的植株过表达或抑制表达都会引起植物光合色素(如叶绿素和类胡萝卜素)、内源激素(如脱落酸和赤霉素)和单萜等萜类物质含量的改变.重点综述了DXS蛋白的特性、基因的类型、基因表达、调控和遗传转化方面的研究进展,以期为植物育种和代谢调节提供理论和实践参考.

以'西伯利亚'百合(Lilium'Siberia')花蕾期、半开期、盛开期、衰败期的花瓣为材料,利用RNA-seq技术对其转录组进行高通量测序,分析单萜合成途径中差异表达的基因并阐明其分子机制.结果显示,'西伯利亚'百合通过转录组测序分析共得到56.28 Gb clean base,223.40 Mb clean reads和124233个unigene,其中35749个基因得到注释.萜骨架合成途径中的基因表达水平在不同花期表现出显著差异.其中,甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸合成酶(HDS)、4-羟基-3-甲丁-2烯基二磷酸还原酶(HDR)、牻牛儿基二磷酸合成酶(GPS)基因的表达水平随花期变化呈先升高后降低的趋势.罗勒烯合成酶(OCS)基因表现出相似变化规律,在盛开期表达量最高.甲羟戊酸(MVA)途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因表达同样出现先升高后降低的趋势.单萜合成下游的分支途径中,茄尼基二磷酸合成酶(SDS)、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDR)基因的表达则出现相反的趋势,在盛开期的表达量最低.研究结果表明MEP途径中的关键基因可随花期变化规律性的表达,以调控单萜的生物合成,在盛开期有较高释放量,且盛开期MVA途径的活化以及泛醌和萜醌代谢支路基因的低表达也促进了单萜的生物合成.