目的:确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。方法:采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统，采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。结果:vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白，但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白，Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离( KD值＝5.71×10 -8和5.89×10 -8 mol/L)，rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4( KD值＝6.4×10 -9和3.2×10 -9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时，上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高( P<0.05)。 结论:LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。

目的 研究过表达miR-338-3p在内皮细胞系EOMA中对炎症信号通路的影响.方法 将EOMA细胞分为四组即对照组、miR-338-3p过表达组、TNF-α处理组、miR-338-3p与TNF-α共处理组.用Real time PCR检测miR-338-3p及黏附分子VCAM-1和ICAM-1mRNA表达水平,Western blot分析ERK/p38 MAPK信号通路活性.结果 与对照组比较,miR-338-3p过表达组的黏附分子VCAM-1及ICAM-1 mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显降低,而TNF-α处理组的黏附分子VCAM-1及ICAM-1 mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显升高;miR-338-3p与TNF-a共处理组与TNF-α处理组比较,黏附分子VCAM-1及ICAM-1 mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显降低;miR-338-3p与TNF-α共处理组与miR-338-3p过表达组比较,黏附分子表达水平及ERK/p38信号通路活性不再升高.结论 过表达miR-338-3p抑制ERK/p38信号通路活性,降低黏附分子VCAM-1和ICAM-1 mRNA表达水平;过表达miR-338-3p能够逆转TNF-α对ERK/p38通路的激活和TNF-α对黏附分子VCAM-1及ICAM-1mRNA表达的促进作用.

目的 探讨沉默雷帕霉素靶蛋白(mTOR)雷帕霉素不敏感组分(RICTOR)表达对血管瘤细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制.方法 采用RNA干扰技术降低血管内皮瘤细胞EOMA中RICTOR的表达量,实验分为对照组、阴性组、转染组,Tr-answell法检测降低RICTOR表达对细胞侵袭、迁移能力的影响,Western印迹检测细胞中RICTOR、丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白的表达量.结果 转染后细胞中RICTOR蛋白的表达量显著降低(P<0.05);沉默RICTOR表达可显著降低细胞的侵袭、迁移能力(P<0.05);转染组细胞中AKT蛋白的表达量没有明显变化,p-AKT、MMP-9蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05).结论 沉默RICTOR表达可通过降低磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信号通路和MMP-9的表达抑制血管内皮瘤细胞EOMA的侵袭、迁移能力.

目的 通过研究散血草乙醇提取物对体外培养的血管内皮瘤细胞(EOMA细胞)生长和凋亡的影响,探讨散血草治疗血管瘤的细胞学基础及理论依据.方法 利用小鼠血管内皮瘤细胞株进行体外细胞培养,将实验细胞分为阴性对照组:B1(单纯PBS溶液处理)和不同浓度散血草乙醇提取物干预组:B2、B3(添加药物分别为100μg/mL、1 mg/mL的散血草乙醇提取物).用散血草乙醇提取物干预培养的细胞.观察比较三组体外培养的EOMA细胞在药物干预24h、48h、72h后的细胞生长情况.结果 干预后对照组血管内皮瘤细胞生长旺盛,而散血草提取物干预组细胞生长相对缓慢,尤以1 mg/ml组为甚.在干预后第24,48,72h时间点上,100μg/ml药物组和1mg/ml药物组细胞Ki67平均荧光强度较对照组低(P＜0.05);1mg/ml药物组细胞平均荧光强度值较100μg/ml药物组低(P＜0.05).在干预后第24,48,72小时时间点上,100μg/ml药物组、1mg/ml药物组细胞凋亡率均较对照组高(P ＜0.05);1mg/ml药物组细胞凋亡率较100μg/ml药物组高(P＜0.05).在干预后72h,100μg/ml药物组、1mg/ml药物组VEGFmRNA的表达较对照组低(P＜0.05).在干预后72h各组间单个细胞上的VEGFR免疫荧光检测表达无明显差异,但同样大小视野内VEGFR表达对照组最多,1mg/ml组最低.结论 散血草乙醇提取物在体外有抑制EOMA细胞生长、促进其凋亡的作用.其对EOMA细胞的作用机制可能与其下调EOMA细胞VEGF的表达水平有关.

目的 研究沉默3-磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)1表达对血管瘤细胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响.方法 采用脂质体Lipofectamine 2000将siRNA-PDK1或siRNA-NC转入小鼠血管内皮细胞瘤细胞系EOMA中,以未转染的细胞作为对照,噻唑蓝(MTT)和流式细胞术检测转染后细胞增殖活性和凋亡率,免疫印迹试验检测细胞中PDK1、Akt、磷酸化(p)-Akt、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3蛋白的表达水平.结果 siRNA-PDK1组PDK1表达量显著低于对照组(P<0.05).与对照组相比,siRNA-NC组细胞的增殖活性(P>0.05)和凋亡率(P>0.05)差异无统计学意义;siRNA-PDK1组细胞增殖活性显著降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05). siRNA-PDK1组细胞中Akt的表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),p-Akt的表达量显著低于对照组(P<0.05),酶切Caspase-3的表达水平显著增加(P<0.05).结论 干扰PDK1表达可有效抑制血管瘤细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能是通过影响PI3K/Akt信号通路介导的下游靶基因的表达量.

Mechanical ventilation (MV) is an important procedure for the treatment of patients with acute lung injury or acute respiratory distress syndrome in a clinical setting;however,MV can lead to severe complications,including ventilator-induced lung injury (VILI).Telocytes (TCs) can promote tissue repair following injury in the heart,kidneys,and other organs.The aim of this study was to investigate the role of TCs in VILI in mice and the associated mechanisms.By using in vivo studies in mice and in vitro studies in cells,we demonstrated that an airway injection of TCs can reduce the pulmonary inflammatory response and improve the lung function in mice with VILI and promote the proliferation of pulmonary vascular endothelial cells.We also demonstrated that the impact of TCs on VILI repair might partially due to vascular endothelial growth factor (VEGF)secreted by TCs upon VILI stimulation,and that VEGF could induce the proliferation of hemangioendothelioma endothelial cells (EOMA).Collectively,our results revealed novel functions of TCs in VILA repair and shed light on the complications that are caused by MV.

目的 了解问号钩端螺旋体LA_2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)和磷脂酶A2(PLA2)的酶活性.方法 生物信息学软件预测问号钩端螺旋体赖株LA_2144基因跨膜区、信号肽和结构域.构建无信号肽LA_2144基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rLep2144后复性.采用分光光度法检测rLep2144水解PAF-AH底物2-thio PAF的活性及其Km和Kcat值以及水解PLA2底物花生四烯酸硫代卵磷脂的活性.采用实时荧光定量RT-PCR和West-ern blot法检测问号钩端螺旋体感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)后LA_2144基因转录、蛋白质表达和外分泌情况.结果 LA_2144基因无跨膜区但有信号肽和SGNH水解酶超家族结构域.所构建的无信号肽LA_2144基因原核表达系统能高效表达rLep2144,提纯后的rLep2144在分离胶上为单一蛋白质条带并成功复性.rLep2144有较强PAF-AH活性,其Km和Kcat值分别为688.235μmol/L和0.976/s,但PLA2活性较弱.问号钩端螺旋体感染HUVEC和EOMA后LA_2144基因mRNA转录和蛋白质表达水平迅速升高(P<0.05)且外分泌.结论 问号钩端螺旋体LA_2144基因产物具有较强PAF-AH活性和一定的PLA2活性,可在钩端螺旋体病出血性病变和炎症反应中发挥作用.

目的 探究干扰长链非编码RNA MALAT1对血管瘤EOMA细胞的生长、运动及小鼠体内肿瘤形成的影响.方法 体外培养血管瘤EOMA细胞, 并分为空白对照组、阴性对照组、目的基因组, 利用干扰RNA敲除MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达, 使用RT-PCR方法检测MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达; 使用Edu染色检测缺失RNA MALAT1后对细胞生长的影响, 使用流式法检测血管瘤EOMA细胞凋亡情况, 使用transwell检测血管瘤EOMA细胞侵袭情况; Western印迹检测血管瘤EOMA细胞中Ki67、 PC-NA、 caspase-3、 caspase-9、 E-cadherin、 N-cadherin蛋白表达情况; 小鼠皮下注射EOMA细胞建立移植瘤模型, 使用RT-PCR检测长链RNA的表达, 检测shRNA敲除Lnc对肿瘤重量的影响, 统计分析小鼠生存期,使用免疫组化检测Ki67和N-cadherin的表达情况.结果 与空白对照组比较, 阴性对照组MALAT1、 Ki67、PCNA、 caspase-3、 caspase-9、 E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达、细胞生长、运动情况均无显著差异 (P>0.05), 与阴性对照组比较, 目的基因组大鼠血管瘤EOMA细胞中MALAT1表达、 EOMA细胞侵袭百分比、Ki67、 PCNA和N-cadherin蛋白表达水平显著降低; EOMA细胞凋亡百分比、 caspase-3、 caspase-9和E-cad-herin蛋白表达水平显著升高, 差异有统计学意义 (P<0.05); 小鼠体内实验发现, 与阴性对照组比较, 目的基因组小鼠体内肿瘤质量、 Ki67和N-cadherin阳性表达率显著降低, 小鼠miR-377-5p表达水平、生存期显著增加, 差异有统计学意义 ( P<0.05).结论 干扰长链非编码RNA MALAT1可以有效地抑制血管瘤EOMA细胞的生长、运动, 促进其凋亡.

目的 探索miR-190a-5p对血管瘤内皮细胞生长、 凋亡及转录因子4(TCF4)水平的影响.方法 采用Lipofectamine?2000构建miR-190a-5p、TCF4过表达EOMA细胞,应用BrdU染色、FCM法、 荧光素酶试验、Western印迹检测增殖、 凋亡、 线粒体膜电位变化、 验证miR-190a-5p与TCF4靶向关系.结果 miR-190a-5p过表达可以抑制EOMA细胞增殖、 促进细胞凋亡与线粒体膜电位下降,靶向作用TCF4,提高Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9水平,降低c-Myc水平.结论 miR-190a-5p过表达可对抑制血管瘤内皮细胞EOMA增殖、 促进细胞凋亡,可能与靶向调控TCF4表达有关.

目的 研究缺氧应激下内皮细胞形态表型改变对小胶质细胞活化、趋化和吞噬活性的调控及机制,解释血-脑屏障(BBB)开放的双时相现象.方法 采用鼠小胶质细胞系(BV2)和鼠血管瘤内皮细胞(EOMA)细胞株进行实验,制作内皮细胞缺氧损伤模型;将BV2细胞分别与正常及缺氧EOMA细胞共育培养,观察前者形态表型变化,检测其趋化和吞噬活性.结果 BV2细胞与缺氧EOMA细胞共育培养后呈现抗炎表型,高表达趋化因子受体及吞噬活性表型.结论 BV2细胞在趋化因子作用下同缺氧EOMA细胞直接接触,可能通过CD200-CD200R通路增强其抗炎和吞噬活性,短时间内有利于恢复血-脑屏障的正常功能.