目的:探讨问号钩端螺旋体溶血素Sph2经高迁移率组蛋白B1(high mobility group box-1，HMGB1)放大炎症反应的可能机制。方法:一定浓度的rSph2与小鼠J774A.1巨噬细胞共孵育一定时间，乳酸脱氢酶(LDH)量的变化检测细胞的膜结构损伤情况；冷冻电镜观察细胞结构的改变；ELISA方法检测细胞上清液中HMGB1的含量变化。商品化的HMGB1与小鼠J774A.1巨噬细胞共孵育一定时间，Western blot检测NF-κB、p38-MAPK及JNK炎症信号通路关键分子的磷酸化水平；ELISA检测IL-1β、IL-6、KC(IL-8)等促炎细胞因子的表达情况。结果:重组问号钩端螺旋体溶血素rSph2可导致J774A.1细胞明显的细胞核消失、细胞膜结构损伤、细胞裂解、膜泡胀；LDH释放量及HMGB1的含量明显增加；HMGB1增加NF-κB、p38-MAPK及JNK信号通路关键蛋白质的磷酸化水平；HMGB1上调J774A.1细胞IL-1β、IL-6、KC的表达且该上调作用可被3条通路抑制剂所抑制。结论:重组问号钩端螺旋体溶血素rSph2诱导小鼠J774A.1巨噬细胞产生损伤并释放大量的HMGB1，HMGB1经NF-κB、p38-MAPK及JNK信号通路调控下游促炎细胞因子的表达，从而放大rSph2造成的炎症效应。

目的:探讨问号钩端螺旋体(简称钩体)跨血管内皮细胞转运分子机制。方法:采用Transwell法了解问号钩体赖株穿越人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)单层能力。采用透射电镜和激光共聚焦显微镜法检测HUVEC内吞问号钩体后形成内吞泡情况。采用细胞内吞抑制试验确定HUVEC内吞问号钩体方式。采用激光共聚焦显微镜法检测HUVEC胞内问号钩体与溶酶体标志分子LAMP1共定位情况。采用暗视野显微镜Petroff-Hausser计数法检测HUVEC胞内问号钩体出胞情况。结果:问号钩体赖株能迅速穿越HUVEC细胞单层。问号钩体通过PI3K-微丝依赖的细胞内吞方式进入HUVEC并形成内吞泡。HUVEC胞内问号钩体不与LAMP1共定位，提示问号钩体内吞泡不与溶酶体融合。HUVEC胞内问号钩体通过FAK-微丝/微管途径出胞。结论:问号钩体通过跨细胞转运方式穿越人血管内皮细胞导致体内播散并加重病情。

目的:了解caspase-11非经典炎症小体对问号钩端螺旋体(钩体)诱导J774A.1细胞分泌炎性细胞因子的影响。方法:采用钩体56601株感染小鼠单核-巨噬细胞株(J774A.1)建立细胞模型，应用real-time RT-PCR检测J774A.1细胞caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA水平，采用ELISA定量检测J774A.1细胞上清液中caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18水平。结果:Real-time RT-PCR检测结果显示，钩体感染J774A.1细胞1、2、4、8、12和24 h后，caspase-11 mRNA水平分别为未感染细胞的5.12、14.21、8.94、14.06、18.58和0.93倍，caspase-11阻断后分别下降至0.10、0.07、0.10、0.09、0.07和0.45倍( P<0.05)；钩体感染后，IL-1β、IL-1α和IL-18 mRNA水平均显著上调，caspase-11阻断后IL-1β mRNA水平分别下降至0.05、0.03、0.02、0.05、0.06和0.02倍( P<0.05)；IL-1α mRNA分别下降至0.14、0.07、0.15、0.10、0.03和0.06倍( P<0.05)；IL-18 mRNA分别下降至0.08、0.10、0.16、0.18、0.10和0.07倍( P<0.05)。ELISA检测结果显示，钩体感染J774A.1细胞后细胞上清液中caspase-11、IL-1β、IL-1α和IL-18水平均显著上调，caspase-11阻断后caspase-11分别下降至43.07、41.64、51.96、86.56、105.36和129.95 pg/ml( P<0.05)；IL-1β分别下降至15.01、14.19、68.02、31.20、173.13和104.98 pg/ml( P<0.05)；IL-1α分别下降至12.14、15.40、38.01、21.97、24.48和27.09 pg/ml( P<0.05)；IL-18分别下降至96.27、102.21、85.34、116.28、155.36和114.03 pg/ml( P<0.05)。 结论:Caspase-11非经典炎症小体参与介导问号钩体诱导小鼠单核-巨噬细胞IL-1β、IL-1α和IL-18的分泌。

目的:确定致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)LA2404基因产物为Sigma N转录因子，鉴定Sigma N信号系统参与调控的下游靶基因。方法:采用生物信息学软件并根据Sigma N调控基因启动子序列特征，预测并分析钩体基因组中LA2404基因及其调控的靶基因。采用等位交换原理构建问号钩体LA2404基因敲除株(ΔLA2404)。采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测ΔLA2404敲除株中候选靶基因mRNA水平变化。构建LA2404基因原核表达系统并提纯目的重组蛋白(rSigma N)。采用凝胶迁移试验(gel electrophoresis mobility shift assay, EMSA)验证Sigma N调控的靶基因。结果:致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株有一个Sigma N编码基因以及22个含Sigma N启动子序列的靶基因。ΔLA2404敲除株有钩体典型、活泼的运动方式，外形无明显变化。ΔLA2404敲除株中LA1188、LA2306、LA3426、LA1968、LA1313、LA3806和LA0773基因mRNA水平显著下调( P<0.05)，其他靶基因mRNA水平无明显变化。EMSA结果显示，rSigma N可与上述靶基因启动子序列结合。 结论:LA2404基因产物为Sigma N调控基因。LA1188、LA2306、LA3426、LA1968、LA1313、LA3806和LA0773的启动子序列能与转录因子Sigma N结合，上述7个基因表达受Sigma N通路调控。

目的:确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。方法:采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统，采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。结果:vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白，但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白，Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离( KD值＝5.71×10 -8和5.89×10 -8 mol/L)，rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4( KD值＝6.4×10 -9和3.2×10 -9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时，上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高( P<0.05)。 结论:LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。

目的:了解铁对问号钩端螺旋体生长繁殖和能量代谢的影响，确定LA_2690与LA_3598基因产物为问号钩端螺旋体储铁蛋白及其亚铁氧化酶功能。方法:采用Petroff-Hausser计数法了解缺铁对问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株在EMJH培养基中生长繁殖的影响。分光光度法和化学发光法检测缺铁抑制问号钩端螺旋体DNA和ATP合成的作用。采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体LA_2690和LA_3598基因结构与功能。构建LA_2690和LA_3598基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rLep2690和rLep3598。分光光度法检测rLep2690和rLep3598亚铁氧化酶活性。实时荧光定量RT-PCR检测问号钩端螺旋体56601株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和单核细胞(THP-1)时LA_2690和LA_3598基因转录水平变化。结果:在缺铁EMJH培养基中，问号钩端螺旋体生长繁殖能力、DNA和ATP合成水平均显著下降( P<0.05)。LA_2690和LA_3598基因产物分别为细菌铁蛋白(Bfr)和细菌DNA结合铁蛋白(Dps)，均含有双亚铁氧化酶中心，但后者缺乏亚铁血红素结合位点和亚铁氧化酶核心。LA_2690和LA_3598基因原核表达系统能高效表达目的重组蛋白rLep2690和rLep3598，提纯后经SDS-PAGE检测均显示为单一的蛋白质条带。rLep2690和rLep3598亚铁氧化酶活性分别为1 238.619和60.052 U/L。感染细胞时，LA_2690和LA_3598基因mRNA水平均显著升高( P<0.05)。 结论:铁离子参与问号钩端螺旋体生长繁殖、DNA和ATP合成。LA_2690和LA_3598基因(Bfr和Dps)均为问号钩端螺旋体感染细胞时所需，其中LA_2690基因产物具有较强亚铁氧化酶活性。

致病性螺旋体的独特侵入、定植、播散和在宿主体内持续生存能力与其表面黏附素密切相关.螺旋体黏附素主要功能是介导其对宿主细胞外基质成分、细胞表面受体、宿主血清和细胞外液成分的黏附.螺旋体黏附素在免疫中的重要作用包括诱导保护性免疫、激活炎症反应,以及通过抗原变异和补体抵抗,导致螺旋体免疫逃逸和形成持久性感染.本文综述了梅毒螺旋体、问号钩端螺旋体和伯氏疏螺旋体的主要黏附素在致病和免疫中作用的研究进展,为深入了解螺旋体的致病机制和设计新型螺旋体疫苗提供依据.

钩端螺旋体病通常被认为是由钩端螺旋体引起的常见动物疾病.一旦黏膜或破损的皮肤与水、土壤接触或直接接触受感染动物的体液,人类就会受到感染[1].钩端螺旋体病的临床表现各异,无明显特异性,难以识别.近年来,宏基因组二代测序(mNGS)技术已应用于临床诊断钩端螺旋体神经病变,提高了罕见病原体的诊断效率[2].本研究报道了1例浙江省台州医院收治的以反复发热为主诉症状的脓毒性休克病例,并通过mNGS检测快速诊断为问号钩端螺旋体导致的败血症.报道如下.

[背景]鼠传疾病是对人类危害较大的一种人兽共患病,全球化使得鼠传疾病流行区域不断扩大,出现了多种新发鼠传疾病的发生及旧传染病的复燃.[目的]调查新疆阿勒泰地区常见的鼠传致病菌在啮齿动物中的流行状况,为当地自然疫源性疾病防控提供科学依据.[方法]采用夹夜法捕获啮齿动物,无菌收集其脾脏和肾脏组织,提取基因组DNA.应用TaqMan探针法的荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测巴尔通体(Bartonella spp.)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)、莫氏立克次体(Rickettsia mooseri)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)6 种常见的鼠传致病菌.采用 16S rRNA 基因的通用引物进行常规 PCR 扩增后,应用Illumina测序和Nanopore测序进一步检测致病菌,同时对脾脏组织进行巴尔通体体外分离培养.比较qPCR、16S rRNA基因测序和分离培养的结果.[结果]共捕获啮齿动物 8 种 66 只,其中,乌拉尔姬鼠(Apodemus uralensis)31 只,占捕获总数的 46.97%,其余为褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)等.qPCR检测常见的鼠传致病菌感染率为巴尔通体 31.80%(21/66)、问号钩端螺旋体 1.50%(1/66)、恙虫病东方体 1.50%(2/66)、莫氏立克次体 3.00%(1/66)和土拉弗朗西斯菌13.60%(9/66),未检出嗜吞噬细胞无形体.16S rRNA基因Illumina测序分析通过质控的 23 份样品检测出致病菌,以巴尔通体为主;16S rRNA基因Nanopore测序分析通过质控的 11 份样品检测出巴尔通体,其他 5 种常见的鼠传致病菌未检出.有 11 份脾脏组织分离培养出巴尔通体,感染率为16.67%(11/66).[结论]新疆阿勒泰地区的啮齿动物可携带巴尔通体等多种鼠传致病菌,应关注并加强该地区相关传染病的防治工作.qPCR、细菌分离培养、16S rRNA基因测序 3 种检测方法可互相补充,更全面地了解当地啮齿动物携带致病菌的状况.

目的 监测重庆市重点地区小型兽类携带5种常见鼠媒病原体的流行情况,为指导当地鼠源疾病的防控提供科学依据.方法 2021-2022年,在重庆市中心城区、万州区、涪陵区3个监测点使用笼夜法捕捉小型兽类,提取其肝、脾、肺、肾组织的核酸样本,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测问号钩端螺旋体(钩体)、莫氏立克次体、巴尔通体,反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测汉坦病毒及大别班达病毒.运用Excel 2010软件进行数据汇总和整理,SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析,种群构成比、病原体携带率的比较采用x2检验进行统计分析.结果 共捕获小型兽类9种1 188只,其中褐家鼠最多,占比为33.50％,黄胸鼠占比为26.77％,四川短尾鼩占比26.01％,小家鼠占比为9.85％,其余还捕获小泡巨鼠、大足鼠、北社鼠、黑线姬鼠、灰麝鼩,不同监测点的小型兽类种类构成差异有统计学意义(x2=714.786,P＜0.001).所有检测样本中,发现汉城型汉坦病毒阳性4份(只),问号钩体阳性24份(只),巴尔通体阳性8份(只),其余均为阴性.共发现33只小型兽类呈阳性,其中2只黄胸鼠、1只褐家鼠同时携带问号钩体和汉城型汉坦病毒,病原体总体携带率为2.78％,其中汉坦病毒总携带率为0.34％,问号钩体总携带率为2.02％,巴尔通体总携带率为0.67％,3种病原体的携带率差异有统计学意义(x2=18.857,P＜0.001).结论 重庆地区小型兽类中监测到问号钩体、巴尔通体和汉坦病毒,检出阳性较多的小型兽类为褐家鼠、黄胸鼠和四川短尾鼩,主要分布于重庆城区的重点行业和万州区的农村居民区,当地应对鼠源疾病流行及防控予以重点关注.