目的:确定问号钩端螺旋体vWF-A基因产物结合人胶原蛋白的作用与机制。方法:采用生物信息学软件分析问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株vWF-A基因(LA_0012、LA_0697和LA_4207)产物结构与功能。构建上述基因vWF-A功能结构域片段原核表达系统，采用SDS-PAGE和Ni-NTA亲和层析法检查目的重组蛋白rLep0012、rLep0697和rLep4207表达情况和提纯效果。采用ELISA和表面等离子共振法(SPR)检测目的重组蛋白与人Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ型胶原蛋白(hCOL1/3/4/6)的结合能力。采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测问号钩端螺旋体赖株感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)时vWF-A基因转录和表达水平变化。结果:vWF-A基因产物均为含vWF-A超家族结构域表面或跨膜蛋白，但LA_0697和LA_4207基因还含有金属离子依赖性黏附位点(MIDAS)。所构建的原核表达系统能有效表达目的重组蛋白，Ni-NTA亲和层析法提纯后SDS-PAGE检测均显示为单一蛋白条带。ELISA结果显示rLep0697与hCOL3/6、rLep4207与hCOL1/4呈强结合。SPR结果显示rLep0697快速结合hCOL3/6但快速解离( KD值＝5.71×10 -8和5.89×10 -8 mol/L)，rLep4207快速并稳定结合hCOL1/4( KD值＝6.4×10 -9和3.2×10 -9 mol/L)。感染HUVEC和EOMA细胞时，上述vWF-A基因转录和表达水平均显著升高( P<0.05)。 结论:LA_0697和LA_4207基因产物可作为问号钩端螺旋体感染过程中的黏附因子。

目的 研究过表达miR-338-3p在内皮细胞系EOMA中对炎症信号通路的影响.方法 将EOMA细胞分为四组即对照组、miR-338-3p过表达组、TNF-α处理组、miR-338-3p与TNF-α共处理组.用Real time PCR检测miR-338-3p及黏附分子VCAM-1和ICAM-1mRNA表达水平,Western blot分析ERK/p38 MAPK信号通路活性.结果 与对照组比较,miR-338-3p过表达组的黏附分子VCAM-1及ICAM-1 mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显降低,而TNF-α处理组的黏附分子VCAM-1及ICAM-1 mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显升高;miR-338-3p与TNF-a共处理组与TNF-α处理组比较,黏附分子VCAM-1及ICAM-1 mRNA表达水平和ERK/p38信号通路活性明显降低;miR-338-3p与TNF-α共处理组与miR-338-3p过表达组比较,黏附分子表达水平及ERK/p38信号通路活性不再升高.结论 过表达miR-338-3p抑制ERK/p38信号通路活性,降低黏附分子VCAM-1和ICAM-1 mRNA表达水平;过表达miR-338-3p能够逆转TNF-α对ERK/p38通路的激活和TNF-α对黏附分子VCAM-1及ICAM-1mRNA表达的促进作用.

目的 探讨沉默雷帕霉素靶蛋白(mTOR)雷帕霉素不敏感组分(RICTOR)表达对血管瘤细胞侵袭、迁移能力的影响及作用机制.方法 采用RNA干扰技术降低血管内皮瘤细胞EOMA中RICTOR的表达量,实验分为对照组、阴性组、转染组,Tr-answell法检测降低RICTOR表达对细胞侵袭、迁移能力的影响,Western印迹检测细胞中RICTOR、丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白的表达量.结果 转染后细胞中RICTOR蛋白的表达量显著降低(P<0.05);沉默RICTOR表达可显著降低细胞的侵袭、迁移能力(P<0.05);转染组细胞中AKT蛋白的表达量没有明显变化,p-AKT、MMP-9蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05).结论 沉默RICTOR表达可通过降低磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信号通路和MMP-9的表达抑制血管内皮瘤细胞EOMA的侵袭、迁移能力.

目的 通过研究散血草乙醇提取物对体外培养的血管内皮瘤细胞(EOMA细胞)生长和凋亡的影响,探讨散血草治疗血管瘤的细胞学基础及理论依据.方法 利用小鼠血管内皮瘤细胞株进行体外细胞培养,将实验细胞分为阴性对照组:B1(单纯PBS溶液处理)和不同浓度散血草乙醇提取物干预组:B2、B3(添加药物分别为100μg/mL、1 mg/mL的散血草乙醇提取物).用散血草乙醇提取物干预培养的细胞.观察比较三组体外培养的EOMA细胞在药物干预24h、48h、72h后的细胞生长情况.结果 干预后对照组血管内皮瘤细胞生长旺盛,而散血草提取物干预组细胞生长相对缓慢,尤以1 mg/ml组为甚.在干预后第24,48,72h时间点上,100μg/ml药物组和1mg/ml药物组细胞Ki67平均荧光强度较对照组低(P＜0.05);1mg/ml药物组细胞平均荧光强度值较100μg/ml药物组低(P＜0.05).在干预后第24,48,72小时时间点上,100μg/ml药物组、1mg/ml药物组细胞凋亡率均较对照组高(P ＜0.05);1mg/ml药物组细胞凋亡率较100μg/ml药物组高(P＜0.05).在干预后72h,100μg/ml药物组、1mg/ml药物组VEGFmRNA的表达较对照组低(P＜0.05).在干预后72h各组间单个细胞上的VEGFR免疫荧光检测表达无明显差异,但同样大小视野内VEGFR表达对照组最多,1mg/ml组最低.结论 散血草乙醇提取物在体外有抑制EOMA细胞生长、促进其凋亡的作用.其对EOMA细胞的作用机制可能与其下调EOMA细胞VEGF的表达水平有关.

目的 研究沉默3-磷酸肌醇依赖性激酶(PDK)1表达对血管瘤细胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响.方法 采用脂质体Lipofectamine 2000将siRNA-PDK1或siRNA-NC转入小鼠血管内皮细胞瘤细胞系EOMA中,以未转染的细胞作为对照,噻唑蓝(MTT)和流式细胞术检测转染后细胞增殖活性和凋亡率,免疫印迹试验检测细胞中PDK1、Akt、磷酸化(p)-Akt、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3蛋白的表达水平.结果 siRNA-PDK1组PDK1表达量显著低于对照组(P<0.05).与对照组相比,siRNA-NC组细胞的增殖活性(P>0.05)和凋亡率(P>0.05)差异无统计学意义;siRNA-PDK1组细胞增殖活性显著降低(P<0.05),凋亡率显著增加(P<0.05). siRNA-PDK1组细胞中Akt的表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),p-Akt的表达量显著低于对照组(P<0.05),酶切Caspase-3的表达水平显著增加(P<0.05).结论 干扰PDK1表达可有效抑制血管瘤细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能是通过影响PI3K/Akt信号通路介导的下游靶基因的表达量.

目的 了解问号钩端螺旋体LA_2144基因产物血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)和磷脂酶A2(PLA2)的酶活性.方法 生物信息学软件预测问号钩端螺旋体赖株LA_2144基因跨膜区、信号肽和结构域.构建无信号肽LA_2144基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rLep2144后复性.采用分光光度法检测rLep2144水解PAF-AH底物2-thio PAF的活性及其Km和Kcat值以及水解PLA2底物花生四烯酸硫代卵磷脂的活性.采用实时荧光定量RT-PCR和West-ern blot法检测问号钩端螺旋体感染人和小鼠血管内皮细胞(HUVEC和EOMA)后LA_2144基因转录、蛋白质表达和外分泌情况.结果 LA_2144基因无跨膜区但有信号肽和SGNH水解酶超家族结构域.所构建的无信号肽LA_2144基因原核表达系统能高效表达rLep2144,提纯后的rLep2144在分离胶上为单一蛋白质条带并成功复性.rLep2144有较强PAF-AH活性,其Km和Kcat值分别为688.235μmol/L和0.976/s,但PLA2活性较弱.问号钩端螺旋体感染HUVEC和EOMA后LA_2144基因mRNA转录和蛋白质表达水平迅速升高(P<0.05)且外分泌.结论 问号钩端螺旋体LA_2144基因产物具有较强PAF-AH活性和一定的PLA2活性,可在钩端螺旋体病出血性病变和炎症反应中发挥作用.

目的 探究干扰长链非编码RNA MALAT1对血管瘤EOMA细胞的生长、运动及小鼠体内肿瘤形成的影响.方法 体外培养血管瘤EOMA细胞, 并分为空白对照组、阴性对照组、目的基因组, 利用干扰RNA敲除MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达, 使用RT-PCR方法检测MALAT1在血管瘤EOMA细胞中的表达; 使用Edu染色检测缺失RNA MALAT1后对细胞生长的影响, 使用流式法检测血管瘤EOMA细胞凋亡情况, 使用transwell检测血管瘤EOMA细胞侵袭情况; Western印迹检测血管瘤EOMA细胞中Ki67、 PC-NA、 caspase-3、 caspase-9、 E-cadherin、 N-cadherin蛋白表达情况; 小鼠皮下注射EOMA细胞建立移植瘤模型, 使用RT-PCR检测长链RNA的表达, 检测shRNA敲除Lnc对肿瘤重量的影响, 统计分析小鼠生存期,使用免疫组化检测Ki67和N-cadherin的表达情况.结果 与空白对照组比较, 阴性对照组MALAT1、 Ki67、PCNA、 caspase-3、 caspase-9、 E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达、细胞生长、运动情况均无显著差异 (P>0.05), 与阴性对照组比较, 目的基因组大鼠血管瘤EOMA细胞中MALAT1表达、 EOMA细胞侵袭百分比、Ki67、 PCNA和N-cadherin蛋白表达水平显著降低; EOMA细胞凋亡百分比、 caspase-3、 caspase-9和E-cad-herin蛋白表达水平显著升高, 差异有统计学意义 (P<0.05); 小鼠体内实验发现, 与阴性对照组比较, 目的基因组小鼠体内肿瘤质量、 Ki67和N-cadherin阳性表达率显著降低, 小鼠miR-377-5p表达水平、生存期显著增加, 差异有统计学意义 ( P<0.05).结论 干扰长链非编码RNA MALAT1可以有效地抑制血管瘤EOMA细胞的生长、运动, 促进其凋亡.

目的 探索miR-190a-5p对血管瘤内皮细胞生长、 凋亡及转录因子4(TCF4)水平的影响.方法 采用Lipofectamine?2000构建miR-190a-5p、TCF4过表达EOMA细胞,应用BrdU染色、FCM法、 荧光素酶试验、Western印迹检测增殖、 凋亡、 线粒体膜电位变化、 验证miR-190a-5p与TCF4靶向关系.结果 miR-190a-5p过表达可以抑制EOMA细胞增殖、 促进细胞凋亡与线粒体膜电位下降,靶向作用TCF4,提高Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9水平,降低c-Myc水平.结论 miR-190a-5p过表达可对抑制血管瘤内皮细胞EOMA增殖、 促进细胞凋亡,可能与靶向调控TCF4表达有关.

目的 研究缺氧应激下内皮细胞形态表型改变对小胶质细胞活化、趋化和吞噬活性的调控及机制,解释血-脑屏障(BBB)开放的双时相现象.方法 采用鼠小胶质细胞系(BV2)和鼠血管瘤内皮细胞(EOMA)细胞株进行实验,制作内皮细胞缺氧损伤模型;将BV2细胞分别与正常及缺氧EOMA细胞共育培养,观察前者形态表型变化,检测其趋化和吞噬活性.结果 BV2细胞与缺氧EOMA细胞共育培养后呈现抗炎表型,高表达趋化因子受体及吞噬活性表型.结论 BV2细胞在趋化因子作用下同缺氧EOMA细胞直接接触,可能通过CD200-CD200R通路增强其抗炎和吞噬活性,短时间内有利于恢复血-脑屏障的正常功能.