目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白，为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板，利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因，经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中，构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达大量蛋白，采用亲和层析方法纯化重组蛋白；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯化水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法鉴定表达产物。 结果:成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒，诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15 × 10 3处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带，且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示，纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。 结论:成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白，为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

目的:分析蛋白EgG1Y162-2通过不同长度接头序列连接后形成的肽段四聚体蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列特征,明确其理化性质及三级结构,预测并对比经不同长度柔性接头连接后其优势抗原表位变化,为增强重组疫苗免疫原性选取最理想的linker序列.方法:利用生物信息学方法选择GSGGSG、GGGGSGGG和GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列进行连接设计EgG1Y162-2(4)重组蛋白疫苗.在线软件ProtParam分析其理化性质;SOPMA在线数据库对设计有不同linker序列的重组蛋白二级结构进行预测分析;I-TASSER在线软件预测所设计重组疫苗的三级结构,并使用SYFPEITHI、IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测.结果:经预测通过GSGGSG、GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列连接的EgG1Y162-2(4)均是稳定蛋白且具有亲水性并得到其二级结构特点.设计的重组疫苗EgG1Y162-2(4)通过生物信息学方法预测得知通过GSGGSG连接的EgG1Y162-2(4)中α螺旋占8.50%,β-转角占16.67%,无规则卷曲约占40.48%,延伸链约占34.35%,该蛋白有8个T/B联合表位,前后串联的EgG1Y162-2蛋白不仅能够正常折叠,且与EgG1Y162-2蛋白相比T/B抗原表位未发生偏移.三级结构显示通过linker序列GSGGSG串联的4个蛋白EgG1Y162-2均能正常表达,而通过GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG串联的蛋白EgG1Y162-2(4)表位发生了一定程度右移.结论:利用GSGGSG 6个氨基酸连接EgG1Y162-2蛋白构成的EgG1Y162-2(4)的T/B联合表位高度重合,表位未发生迁移说明蛋白EgG1Y162-2(4)通过这种方式连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白优势表位造成影响,并通过重复蛋白表位数增强疫苗免疫应答效果,制备有效的棘球蚴病表位疫苗.

目的 分析蛋白egG1y162-1、egG1y162-2的氨基酸序列,了解其理化性质及二级结构特点,预测比较其抗原表位,为包虫病的免疫学诊断及表位疫苗的研制提供理论依据.方法 采用生物信息学技术,利用在线软件ProtParam分析egG1y162-1和egG1y162-2的理化性质,使用DNAstar软件的protean等程序分析egG1y162-1和egG1y162-2蛋白的二级结构特点,运用在线软件IEDB等对egG1y162-1和egG1y162-2蛋白各参数进行综合分析并预测其抗原表位.结果 综合分析各参数预测egG1y162-1的优势B细胞表位为9～28位氨基酸残基(LTKELKT-TLPEHFRWIHVGS),egG1y162-1上29～36位氨基酸残基(RSLELGWN)区域可能存在人鼠共同T细胞抗原表位;egG1y162-2的优势B细胞表位为25～39位氨基酸残基(EGLKPSTFYEV-VVQAFKGGS)、41～60位氨基酸残基(KGGSQVFKYTGFIRTLAPGE),egG1y162-2上26～41位氨基酸残基(GLKPSTFYEVVVQAFK)区域可能存在人鼠共同T细胞抗原表位.结论 通过对细粒棘球绦虫蛋白egG1y162-1、egG1y162-2进行抗原表位分析,发现二者均存在评分较高的优势T表位和B表位,且存在人鼠共同T表位,而egG1y162-2的各方面指标要优于egG1y162-1,这对包虫病的诊断和疫苗研究有重要意义.

目的 探讨重组BCG-EgG1Y162蛋白免疫小鼠后,感染包虫病的小鼠免疫细胞Tim-3因子的动态改变和表达.方法 采用实验小鼠30只,随机分为2组,实验组用BCG-EgG1Y162疫苗免疫小鼠,对照组注射生理盐水,各免疫1次.免疫第10周后,用细粒棘球蚴进行小鼠腹腔内注射,在免疫后的第24周采血,用实时荧光定量PCR法分别检测15例正常对照组小鼠和15例实验组小鼠外周血中Tim-3、Galectin-9的表达,同时用酶联免疫吸附(ELISA)法检测2组血清中可溶性Tim-3、Galectin-9及IFN-γ、IL-12和IL-4的水平.流式细胞仪检测小鼠脾细胞悬液中Tim-3、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T细胞的表达.结果 经实时荧光定量PCR检测结果显示:正常对照组的小鼠在感染包虫后体内的Tim-3和Galectin-9 mRNA水平显著升高,实验组小鼠在经过BCG-EgG1Y162疫苗免疫后,体内的Tim-3和Galectin-9水平显著降低与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).ELISA实验检测显示:实验组小鼠血清中存在的可溶性Tim-3和Galectin-9水平,与正常对照组相比,水平显著降低;流式细胞仪检测也发现免疫组存在Tim-3降低.结论 小鼠在经过BCG-EgG1Y162疫苗免疫后,在细粒棘球蚴持续性感染中能够明显纠正Tim-3、Galectin-9的高表达,进一步影响Th1/Th2的相关转录因子T-bet/GATA-3和细胞因子IFN-γ、IL-12和IL-4的水平的改变,从而纠正Th1/Th2免疫细胞失衡的现象,抑制感染的进一步发展.

目的 研究和对比经生物信息学分析后重组构建的EgG1Y162-1/2蛋白诱导小鼠产生免疫应答反应的特点.方法 随机将60只小鼠分5组,根据所注射抗原的不同分为EgG1Y162-1组、EgG1Y162-2组、GST对照组、佐剂组和正常对照组.每2周免疫1次,共免疫4次.采集免疫前后的小鼠血清进行Elisa检测抗体效价;流式细胞术检测不同时间点淋巴细胞亚群(CD4+T细胞和CD8+T细胞)的动态变化;免疫10周后用细粒棘球蚴感染攻击小鼠,对比小鼠脾淋巴细胞体外刺激后的增殖反应、脾细胞凋亡率和小鼠囊重抑制率的检测结果.结果免疫后第10周,EgG1Y162-2组抗体滴度为1:20480高于EgG1Y162-1组抗体滴度1:5120.经原头蚴感染攻击的EgG1Y162-2组的淋巴细胞亚群(CD4+T细胞、CD8+T细胞)百分比均高于EgG1Y162-1组,且差异有统计学意义(P<0.05),但CD4+T/CD8+T细胞比值差异无统计学意义(P>0.05).免疫后的EgG1Y162-2组小鼠脾淋巴细胞在体外被特异性刺激后增殖水平高于EgG1Y162-1组,差异有统计学意义(P<0.05).检测显示EgG1Y162-2组的脾细胞凋亡率低于EgG1Y162-1,差异有统计学意义(P<0.05).疫苗保护实验中发现EgG1Y162-1组的小鼠囊重抑制率比EgG1Y162-2组低,差异有统计学意义(P<0.05).结论 EgG1Y162-2抗原比EgG1Y162-1抗原具有更强的免疫优势作用,本研究不仅证明了生物信息学分析表位的准确性,也提示该表位信息丰富的抗原值得作为疫苗的保护性抗原进行深入研究.

目的 初步研究细粒棘球蚴重组抗原蛋白BCG-egG1Y162的免疫原性.方法 选取60只小鼠分别分为3组实验组、重组卡介苗组和正常组小鼠分别注射重组抗原蛋白BCG-egG1Y162、重组卡介苗(BCG)和生理盐水(NS).在免疫的第0、2、4、6、8周收集各组小鼠的血清,通过酶联免疫吸附法(ELISA法)检测血清中抗体IgG的动态变化水平.在第8周随机处死各组一半数量的小鼠提取脾淋巴细胞,分别通过四甲基偶氮咗蓝实验(M T T法)以及ELISA法检测小鼠脾淋巴细胞体外增殖反应和细胞上清中IFN-γ、IL-4的水平变化.在免疫后第8周用活棘球蚴原头蚴感染各组存活的小鼠,感染后第24周处死各组小鼠,检测血清中IgG水平、包囊个数及其直径.结果 (1)免疫后的第2～8周,BCG-egG1Y162免疫组小鼠血清中IgG持续升高,与正常组和BCG组相比差异具有统计学意义(P<0.05).BCG组和正常组的IgG水平之间的差异不具有统计学意义(P>0.05).(2)BCG-egG1Y162免疫组小鼠的脾淋巴细胞在体外能被BCG-egG1Y162特异性的刺激增生,增殖水平显著高于BCG组和正常组(P<0.05),其上清中IFN-γ、IL-4的水平以及IFN-γ/IL-4的比值同样显著高于正常组和BCG组(P<0.05).这些指标在BCG组和正常组之间的差异不具有统计学意义(P>0.05).(3)在各组小鼠感染活棘球蚴原头蚴后的第24周,BCG-egG1Y162免疫组具有87.3％ 的免疫保护力,并且血清中的IgG水平显著高于BCG组和正常组(P<0.05).结论 细粒棘球蚴重组抗原蛋白BCG-egG1Y162免疫小鼠后可上调小鼠血清中抗体IgG的水平,刺激脾淋巴细胞增殖活化,特异性地增强脾淋巴细胞的T h1免疫反应和机体抵抗细粒棘球蚴感染的能力,说明BCG-egG1Y162是具有研究价值的细粒棘球蚴病候选疫苗分子.

目的 优化探索重组质粒pET30a-EgG1 Y162-2蛋白表达条件并预测其蛋白结构模型. 方法 将构建的重组质粒pET30a-EgG1 Y162-2转化至E.coli BL21 (DE3)菌株中,用不同浓度的IPTG进行不同时间段的蛋白诱导表达,诱导后的菌液超声破碎、离心,分别取上清和沉淀用SDS-PAGE分析重组蛋白EgG1Y162-2的表达情况,Western blot鉴定表达蛋白的反应原性.采用在线SWISS MODEL预测EgG1Y162-2蛋白的三维结构. 结果 EgG1Y162-2蛋白在37℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,诱导4h条件下的表达量较高,蛋白相对分子质量约为15×103,与预期相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别.在线Swiss-model预测EgG1Y162-2-2蛋白3D结构模型,与4Ixo.1.A结构的相似度为37.71％. 结论 优化的重组蛋白EgG1Y162-2表达最优条件预测的该蛋白三维结构,为细粒棘球蚴疫苗EgG1Y162-2抗原的功能研究奠定了基础.

目的 研究以卡介苗为载体的细粒棘球绦虫egG1Y162融合蛋白(rBCG-egG1Y162)免疫小鼠的免疫应答改变,评价其在小鼠实验中发挥的动物免疫保护作用,为研究新型有针对性的囊型包虫病疫苗奠定基础.方法 免疫保护性评价实验分为3组:rBCG-egG1Y162组、卡介苗(BCG)组和正常对照(NS)组,用重组疫苗免疫Balb/c小鼠,肌肉注射疫苗第8周后用攻虫实验感染各组一半数量小鼠,在第24周后获取小鼠相应的器官和血清标本.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中IgG亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgE抗体水平变化,评价疫苗的体液免疫水平.计算小鼠感染模型中细粒棘球蚴的包囊数量及其大小,对包囊湿重进行称量,评价该重组疫苗对小鼠的免疫保护性.结果 与BCG组和NS组相比,rBCG-egG1Y162免疫组小鼠血清中IgG2a、IgG2b和IgE抗体水平增高,差异有统计学意义(P<0.05),IgG1抗体水平降低,差异有统计学意义(P<0.05).各组小鼠在免疫后被动感染棘球蚴,rBCG-egG1Y162免疫组具有78.1％的囊泡抑制率,Eg囊湿重与BCG组和NS组相比差异有统计学意义(P<0.05),结论 以 BCG 为载体的 rBCG-egG1Y162 疫苗免疫小鼠后,攻虫实验中的囊泡抑制率显著增高,小鼠体内寄生虫的数量也显著减少,初步认为 rBCG-egG1Y162 可以作为囊型包虫病的候选疫苗进行深入研究.

目的 采用生物信息学的方法,应用相关软件对EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的氨基酸序列进行分析,了解其理化性质及结构特点,预测并比较其抗原表位,为CTLA-4IgV-EgG1Y62-2蛋白作为包虫病表位疫苗的研究奠定基础.方法 利用ProtParam在线软件分析EgG1Y162-2和CTLA 4IgV-EgG1Y162-2蛋白的理化性质;运用DNAstar中的protean软件与在线SOPMA软件预测EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的二级结构;应用I-TASSER在线软件预测并比较EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白的三级结构,并使用BepiPred1.0,IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测与分析.结果 预测EgG1Y162-2蛋白由69个氨基酸组成,为稳定蛋白,具有亲水性.二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占7.69％、30.77％、15.38％和46.15％.预测的3条T细胞优势表位分别是1-18、21-43和47-62位氨基酸,2条B细胞优势抗原表位分别是9-28与57-69位氨基酸;CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白由208个氨基酸组成,稳定蛋白,具有亲水性.二级结构中的α螺旋、β-折叠、β-转角与无规则卷曲分别占13.46％、32.21％、7.69％和46.63％.预测的3条优势T细胞表位分别是143-154、165-177和183-199位氨基酸.2条B细胞优势抗原表位分别为151-167和197-205位氨基酸.结论 EgG1Y162-2和CTLA-4IgV-EgG1Y162-2蛋白均存在优势T抗原表位与B抗原表位,且T/B联合表位存在高度重合.说明CTLA-4IgV与EgG1Y162-2蛋白通过Linker序列连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白的优势表位产生影响.因此,将CTLA-4IgV基因与特异性抗原EgG1Y162-2基因进行融合表达可能会增强疫苗的免疫效果,这对囊型包虫病多价复合疫苗的研究具有重大意义.

目的 探索重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162最佳的表达条件,大量诱导及鉴定蛋白质,并预测重组蛋白质的三维结构模型.方法 将原核重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162转化至E.coli.BL21 (DE)菌株中,在不同条件下诱导重组蛋白进行表达,SDS-PAGE分析上清及沉淀中重组蛋白表达并用Western blot鉴定.I-TASSER在线预测重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的三维结构.结果 可溶性重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162在异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)(终浓度0.2 mmol/L),28℃ 4h诱导条件下表达量较高;包涵体中的重组蛋白在IPTG(终浓度0.8 mmol/L),28℃ 2h并37℃ 2h诱导条件下表达量最高.Western blot鉴定该蛋白的相对分子量约为32×103,与预期相符.利用I-TASSER在线预测重组蛋白质HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的3D结构模型,结果显示相邻的蛋白CTLA-4IgV与蛋白EgG1Y162能抵抗空间位阻的影响进行正常折叠.结论 探索出重组蛋白HIS-CTLA-4IgV-EgG1Y162的最佳诱导表达条件并对重组蛋白成功鉴定,根据预测的重组蛋白3D结构验证选用linker序列"GTDDDDKAMADIGSEF"能使其前后相邻的两个蛋白独立正常折叠,为进一步深入研究细粒棘球蚴重组疫苗创造了条件.