目的:探讨全基因组测序筛选非小细胞肺癌(NSCLC)敏感甲基化位点的肺癌早期预警体系的构建。方法:本研究选择2014年3月至2016年11月在江南大学附属医院肿瘤科接受NSCLC手术切除的患者。实验分为两组：正常组织、非小细胞肺癌组织，通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测NSCLC细胞中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、β-微管蛋白Ⅲ(TUBB3)和核糖核苷还原酶调节因子1(RRM1) mRNA的表达；通过全基因组测序检测NSCLC细胞甲基化在基因上分布，使用测序数据进行胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)甲基化图谱分析(CpG甲基化分析)，组蛋白修饰数据分析组蛋白修饰和DNA甲基化之间的关系，通过蛋白质免疫检测正常组织和非小细胞肺癌组织中组蛋白甲基化蛋和甲基化相关酶的表达。 t检验(或Wilcoxon秩和检验)和 χ2检验(或Fisher精确检验)分别用于分析连续和分类变量。Pearson(或Spearman)的秩相关系数用于分析两个连续变量之间的相关性。使用R软件(版本3.1.1)进行统计分析。 结果:与对照细胞比较，NSCLC细胞中ERCC1[(0.78±0.14)比(0.12±0.04)， χ2＝6.370， P<0.05]、TUBB3[(0.48±0.11)比(0.08±0.02)， χ2＝1.240， P<0.05]和RRM1 mRNA[(0.52±0.07)比(0.05±0.01)， χ2＝5.360， P<0.05]的表达下调表达；NSCLC组甲基化水平在转录起始位点升高，在基因间区降低( χ2＝3.140， P<0.05)；NSCLC组发现9个CpG的甲基化敏感位点(RUNX3、MIR196A1、HOXA11、OTP、GATA4、PTPRU、SLC15A3、ZIC1和TFAP2B)；NSCLC组与对照组比较，组蛋白乙酰化(H3K9ac[(43.57±8.84)比(10.64±4.35)， χ2＝8.730， P<0.05]和H3K27ac[ (40.52±8.64)比(9.67±3.58)， χ2＝5.470， P<0.05])和组蛋白甲基化(H2az[(42.56±9.74)比(12.47±6.05)， χ2＝7.420， P<0.05]，H3K4me1[(37.47±6.42)比(15.46±7.34)， χ2＝5.380， P<0.05]，H3K4me2[(50.37±10.24)比(9.47±6.54)， χ2＝9.270， P<0.05]，H3K4me3[(52.37±6.49)比(10.58±5.88)， χ2＝1.690， P<0.05]和H3K79me2[(34.55±6.42)比(11.23±6.94)， χ2＝3.450， P<0.05])降低；NSCLC组DNMT1(1.88±0.24)比(0.12±0.01)， χ2＝5.430， P<0.05]、DNMT3a(1.75±0.36)比(0.49±0.11)， χ2＝7.890， P<0.05]、DNMT3b(0.88±0.14)比(0.13±0.05)， χ2＝1.360， P<0.05]、H3K4me3(2.53±0.35)比(0.35±0.08)， χ2＝5.440， P<0.05]和H3K9me2(0.55±0.07)比(0.05±0.01)， χ2＝3.270， P<0.05]下调表达( P<0.05)。 结论:组蛋白修饰和DNA甲基化密切相关，组蛋白甲基化和甲基化相关酶的表达也受到影响，甲基化敏感位点可以作为早期检测NSCLC的生物标志物。

[目的] hDOT1L基因在白血病发病机制中的作用和临床意义,并分析其可能的作用机理,以期揭示白血病治疗的新靶点.[方法]收集和提取非恶性血液病患者和各组白血病患者的骨髓单个核细胞(BMMNC).RT-PCR检测各组细胞内hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10 (MLLT10)的mRNA表达水平.应用Western blot法检测各组细胞内hDOT 1L蛋白的表达及H3K79双甲基化蛋白表达水平,并检测各组p-MAPK、p-AKT和PI3K蛋白的表达水平.[结果]RT-PCR结果显示,急性髓系白血病(AML)组、急性淋巴细胞白血病(ALL)组及急性白血病复发(AL-relapse)组BMMNC中hDOT1L、HOXA9、HOXA10、MLL-AF10基因在mRNA水平明显高于对照组和急性白血病缓解组(AL-CR组),且差异显著(P＜0.01);AML组、ALL组及AL-relapse组组间比较及AL-CR组与对照组比较均无明显差异(P＞0.05).Western blot检测结果表明,AML组和ALL组及AL-relapse组BMMNC中hDOT1L和H3K79-me2(双甲基)蛋白表达水平及AKT、p-AKT和PI3K蛋白显著高于对照组和AL-CR组,并有统计学意义(P＜0.01);AML组和ALL组及AL-relapse组之间比较及AL-CR组与对照组比较上述蛋白表达水平均无统计学差异(P＞0.05).[结论] hDOT1L是一种新型的组蛋白赖氨酸甲基转移酶,它可能通过提高H3K79的甲基化水平,诱导其下游HOXA9、HOXA10、MLL-AF10基因的表达,及影响细胞内其他信号通路参与急性白血病的发生,并与疾病的预后息息相关;阻断此通路可能是治疗白血病的一个新思路.

目的 研究组蛋白H3K79甲基化转移酶Dot1l在豚鼠耳蜗中的表达情况.方法 将6只听力正常的豚鼠取材,运用免疫组织化学技术检测Dot1l在豚鼠耳蜗各转中的表达差异.结果 Dot1l表达于豚鼠耳蜗的血管纹、螺旋韧带、前庭膜、螺旋神经节、Corti器、螺旋缘、外螺旋沟细胞,在螺旋韧带的表达由底转向顶转减少(F=8.29,P=0.0091),在螺旋神经节中的表达由底转向顶转逐渐增多(F=6.22,P=0.0201),差异具有统计学意义.结论:豚鼠耳蜗中存在与ENaC表达相关的组蛋白H3K79甲基化转移酶Dot1l,其可能参与内淋巴循环.

白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤,其中急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)约占所有白血病的59％,其发病机理尚不十分清楚,现认为多种因素在多个层面、多个阶段的相互作用导致白血病的发生.NPM1蛋白可以穿梭于胞浆与胞核之间,并主要定位于细胞核内,与多种蛋白结合.NPM1突变在急性髓系白血病中占25～30％,产生的突变的NPM1蛋白因缺乏核定位肽段而滞留于细胞浆,对细胞核的稳定性以及某些癌基因的表达产生负面影响.在含有NPM1基因突变的AML中,约70％的病人同时含有DNA甲基化调节基因的突变(DNMT3A、IDH1、IDH2、TET2等),并且已知表观遗传学的异常可以直接破坏核稳定性,上调某些白血病相关基因的高表达.NPM1突变基因的白血病细胞具有特殊的基因表达特征,如HOX家族基因、MEIS1基因在突变系统中显著高表达,这些基因不仅是引发白血病的关键调节子,而且是MLL融合蛋白的下游靶点.在携带有MLL融合蛋白的AML中,MLL的融合伴侣可以募集DOT1L,对MLL靶点基因上的H3K79位点进行甲基化,造成这些基因过度活化.同MLL基因的异常相比,NPM1突变保持着相似的转录特点,然而NPM1突变是否能够影响组蛋白H3K79甲基化的变化还不是很清楚.本综述着重探讨NPM1突变与H3K79甲基化的关系,以及H3K79甲基化转移酶DOT1L抑制剂对NPM1突变的AML的作用,从而为白血病发病寻求新的分子机制和治疗策略.

Dotl (disruptor of telomeric silencing 1)最初在芽殖酵母中通过遗传筛选基因被发现,缺失则会引起端粒沉默.Dot1和其脊椎动物同源物DOT1 L(Dot1-like)都具有催化组蛋白H3第79位赖氨酸(H3K79)甲基化的组蛋白甲基转移酶活性.在人类各种组织中,DOT1L基因启动子区域的CpG岛均呈现极低的DNA甲基化水平,说明DOT1L基因在人体中广泛中等程度表达.DOT1L基因在EBV转化的细胞及睾丸中表达水平升高.Dot1/DOT1L介导的H3K79甲基化参与多种生物学过程,并在小鼠基因损伤实验中发现DOT1L在心功能、红细胞生成、白血病及多种肿瘤的疾病发展中起重要的作用,因而DOT1L已成为针对表观遗传修饰因子的重要药物靶点.本文对Dot1/DOT1L在生理和病理方面的研究进展作一综述.

目的:为了研究组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化和三甲基化(H3K79me2,3)水平在骨肉瘤细胞有丝分裂期的变化及对有丝分裂期进程的影响.方法:利用细胞周期同步化方法,观察骨肉瘤细胞U2OS在有丝分裂期前中期到出有丝分裂期各阶段H3K79me2,3水平的变化;并用特异性抑制剂EPZ5676抑制H3K79甲基化水平,用Western blot及活细胞荧光激光共聚焦检测其对有丝分裂期进程的影响.结果:在骨肉瘤细胞U2OS中,H3K79me2,3水平在有丝分裂期前中期下降,并随着细胞出有丝分裂期,H3K79me2,3水平逐渐增加,使用抑制剂进一步降低其在有丝分裂期的水平并抑制其随后的增加,对有丝分裂期中期到后期的转化过程影响不明显,但会引起姐妹染色单体分离错误出现的比例增高(x2=4.99,P=0.026).结论:H3K79me2,3水平在骨肉瘤有丝分裂期前中期降低,并随着细胞出有丝分裂期逐渐升高,这种变化可能与确保姐妹染色单体正确分离的相关调控有关.

目的 观察饮水砷暴露对人群外周血白细胞中组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)和H3第79位赖氨酸三甲基化(H3K79me3)修饰水平的影响,分析砷暴露与H3K4me3和H3K79me3修饰水平的关系.方法 采用整群抽样的调查方法,在山西省和吉林省饮水型地方性砷中毒典型病区开展现场调查,选择饮水年限≥10年的当地常住居民281人作为调查对象.受检人群按照饮用水砷含量分为对照组(水砷含量≤0.01 mg/L,60例)、低水砷暴露组(＞0.01～0.05 mg/L,61例)、中水砷暴露组(＞0.05～0.10 mg/L,50例)、高水砷暴露组(＞ 0.10 mg/L,110例).采集调查对象的饮用水样、即时尿样和外周血样.采用原子荧光法检测饮水砷含量和尿砷含量:斑点杂交方法(Dot Blotting)检测外周血白细胞中组蛋白H3K4me3和H3K79me3的修饰水平.结果 对照组,低、中、高水砷暴露组间年龄(61.50、60.00、59.50、59.50岁)、性别(男:20、27、17、40例,女:40、34、33、70例)、体质指数(BMI)、吸烟及饮酒情况比较,差异无统计学意义(P均＞0.05).对照组,低、中、高水砷暴露组水砷含量中位数分别为0.005、0.024、0.076、0.150 mg/L;尿砷含量中位数分别为0.011、0.018、0.061、0.134 mg/L;水砷累积暴露量中位数分别为0.342、1.641、5.273、7.716 mg,组间比较差异有统计学意义(H=256.041、88.615、218.610,P均＜0.01).对照组,低、中、高水砷暴露组人群外周血白细胞中H3K4me3(0.100、0.059、0.083、0.083)、H3K79me3 (0.049、0.036、0.055、0.052)修饰水平比较,差异无统计学意义(H=1.488、2.097,P均＞0.05).外周血白细胞H3K4me3、H3K79me3修饰水平与水砷含量、尿砷含量、水砷累积暴露量呈正相关关系(r=0.245、0.221,0.299、0.318,0.149、0.149,P＜0.01或＜0.05);H3K4me3与H3K79me3修饰水平之间呈正相关关系(r=0.811,P＜0.01).结论 饮水砷暴露虽然与人群外周血白细胞中H3K4me3和H3K79me3修饰水平存在正相关关系,但仍需扩大样本量进一步研究.

MLLT3/AF9基因属于组蛋白甲基转移酶家族成员,从含有t(9,11)(p22;q23)易位的人白血病中得到.其通过识别组蛋白H3K9(组氨酸3赖氨酸9)乙酰化修饰,募集组蛋白甲基转移酶DOT1L催化H3K79甲基化的共沉积和基因活化,从而参与调节细胞的增殖、分化和凋亡.MLLT3/AF9基因能够引起全基因组转录表达的异常,从而参与多种肿瘤的发生、发展及预后,并且在机体的成长和发育中发挥着至关重要的作用.本文对MLLT3/AF9基因在细胞中表达及其与细胞生物学行为关系的研究进展作一综述.

目的 调节蛋白混合性白血病(regulatory protein mixed lineage leukaemia,MLL)是常见的复发/难治性急性白血病,目前仍无标准有效的治疗方案,急需研发新的靶向药物.本研究旨在检测小干扰RNA(siRNA)沉默人类组蛋白赖氨酸甲基转移酶hDOT1L基因表达对人单核细胞白血病细胞株THP-1细胞增殖的影响,探讨hDOT1L基因在白血病发病中的作用机制.方法 利用LipofectamineTM 2000将hDOT1L siRNA转染体外培养的THP-1细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测hDOT1L siRNA单独或与地西他滨(Decitabine)联合应用对THP-1细胞增殖的影响.采用RT-PCR法检测THP-1细胞hDOT1L、HOXA9、HOXA10和MLL-AF10(MLLT10)mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测THP-1细胞H3K79甲基化水平、hDOT1L蛋白表达水平及PI3K/AKT通路中关键分子表达变化.结果 MTT结果显示,与对照组相比(0.17±0.02),hDOT1L siRNA单独(0.56±0.04)或与地西他滨联合应用(0.66±0.06)48 h后可明显抑制THP-1细胞增殖,F=284.225,P<0.001.RT-PCR结果表明,THP-1细胞的HOXA9、HOXA10、MLLT10和hDOT1L mRNA表达水平在hDOT1L siRNA组分别为0.34±0.06、0.27±0.06、0.32±0.08和0.26±0.07;在hDOT1L siRNA+Decitabine组分别为0.15±0.06、0.14±0.05、0.16±0.06和0.13±0.06;与对照组(0.92±0.18、0.77±0.13、0.79±0.13和0.68±0.14)比较明显下降,差异有统计学意义,均P<0.001.蛋白质印迹法检测mono-H3K79、di-H3K79、tri-H3K79蛋白表达水平在对照组分别为0.54±0.06、0.58±0.09和0.75±0.05,hDOT1L siRNA组分别为0.44±0.02、0.31±0.06、0.41±0.09,hDOT1L siRNA+Decitabine组分别为0.38±0.08、0.21±0.03、0.27±0.04,均较对照组明显降低,均P<0.001;Control siRNA组细胞内T-AKT、p-AKT、PI3K及hDOT1L蛋白表达水平分别为0.70±0.15、0.71±0.13、0.49±0.14、0.72±0.05,hDOT1L siRNA组分别为0.64±0.12、0.51±0.04、0.30±0.04和0.36±0.04,hDOT1L siRNA+Decitabine组分别为0.65±0.05、0.31±0.09、0.22±0.04和0.24±0.04,后两组与Control siRNA组相比,细胞内p-AKT、PI3K及hDOT1L蛋白表达水平明显下降,差异均有统计学意义,P<0.001;而总AKT(T-AKT)蛋白表达水平在各组间比较差异均无统计学意义,F=0.667,P=0.578.结论 hDOT1L基因可能通过增加白血病细胞H3K79基因甲基化水平,诱导MLL相关基因及PI3K/AKT通路中关键分子的表达,促进白血病细胞增殖而参与白血病发病机制.hDOT1L有望成为治疗白血病的新靶标,hDOT1L抑制剂与地西他滨联合应用有望进一步提高白血病治疗疗效.

组蛋白甲基化是发生在核小体核心组蛋白各亚基N-端肽链的一种修饰方式.在组成核小体的4种亚基中,H3亚基N-端肽链第4、9、27、36和79等位点的赖氨酸为甲基化热点,甲基化类型包括一、二、三甲基化(mono-,di-,tri-methylation).H3K27me3是发生在组蛋白H3亚基第27位赖氨酸的三甲基化,主要发挥转录抑制的作用,参与骨骼肌的发育调控.研究表明,H3K27me3能够与骨骼肌增殖和分化的关键转录因子(如MyoD和MyoG等)及细胞周期蛋白特异性结合,并与其他表观遗传调控因子lncRNA及miRNA等互作,对骨骼肌的增殖和分化时间以及程度进行精细调控.本文系统介绍了组蛋白甲基化的类型以及H3K27甲基化和去甲基化的生物学过程,总结了目前已报道的H3K27me3在骨骼肌成肌细胞增殖和分化过程中发挥的作用,以期辅助科研工作者了解H3K27me3在骨骼肌发育过程中的作用,以及为进一步提高哺乳动物肌肉品质提供参考.