目的:探讨Cyclin D1、Ki-67的表达和5项甲状腺癌相关基因突变与甲状腺乳头状癌(PTC)发生远处转移的关系.方法:收集2015年9月-2022年12月PTC发生远处转移病例(18例)和未发生转移病例(25例)的标本,采用免疫组化法检测Cyclin D1和Ki-67的蛋白表达,PCR法检测5项基因(KRAS、NRAS、BRAF、TERT和HRAS)突变情况,比较远处转移组和未转移组的组间差异.结果:①PTC远处转移组和未转移组中Cyclin D1的高表达率分别为72.2％和40.0％,Ki-67的高表达率分别为66.7％和36.0％,差异均具有统计学意义(P＜0.05).②在PTC远处转移组中检测到甲状腺癌相关5项基因改变15例次(其中BRAF V600E突变10例次,TERT启动子突变4例次,NRAS突变1例次);PTC未转移组中检测到基因改变15例次,均为BRAF V600E突变.③PTC远处转移组TERT突变率22.2％,显著高于PTC未转移组(0％),差异有统计学意义(P＜0.05).结论:Cyclin D1、Ki-67高表达或BRAF V600E和TERT启动子共突变可作为预测PTC发生远处转移的重要指标.

目的 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生具有显著的性别差异,但其分子机制尚不清楚.本研究通过检测Hras12V转基因小鼠雌雄肝肿瘤组织的蛋白质组学表达差异,探讨肝肿瘤发生的性别差异机制.方法 采用双向荧光差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术检测Hras12V雌雄小鼠肝肿瘤组织的蛋白质组学差异表达谱,分离并鉴定差异表达蛋白,应用蛋白质印迹法验证2 D-DIGE结果,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析,包括蛋白功能注释、分类(gene ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析.结果 经双向荧光差异凝胶电泳-图像分析得到1313个蛋白点,其中差异倍数≥1.5(P<0.05)的蛋白点553个.从中选择94个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定,得到56种差异性表达的蛋白质.其中,与雌鼠相比,雄鼠肝肿瘤组织中高表达的蛋白有43种,低表达的蛋白有13种.选取4个差异蛋白FABP1、Albumin、Prdx6和CALR进行了蛋白质印迹法验证,其中FABP1在雄鼠肝癌中显著上调,Albumin和Prdx6在雄鼠肝癌中显著下调,CALR在雌雄小鼠肝癌中差异无统计学意义,结果与质谱数据基本一致,证明了2D-DIGE结果的可靠性.对雌雄鼠肝肿瘤组织中的差异蛋白进行GO分析,细胞组分分析显示,差异蛋白主要分布在细胞质、细胞溶质、线粒体和细胞核中;分子功能分析显示,差异蛋白主要承担poly(A)RNA结合、ATP结合和酶结合等功能;生物过程分析显示,差异蛋白主要参与运输、脂代谢过程和凋亡过程的负调控等.KEGG通路分析结果表明,差异蛋白涉及9条信号通路,主要通路包括代谢途径、内质网加工过程和细胞色素P450的异物代谢等通路.结论 Hras12V转基因小鼠雌雄肝肿瘤组织的差异性蛋白表达的检测,为研究性别差异性肝癌发生分子机制提供了基础生物学信息和有益的线索.

目的:分析含有HRAS(V112A)基因及其G12C、G13C、Q61R和G12C/G13C/Q61R突变体的质粒DNA在NIH小鼠体内的致癌性.方法:从人结肠癌DiFi细胞中扩增含有V112A突变的HRAS(V112A)基因,采用PCR点突变法在HRAS(V112A)中分别引入G12C[HRAS(V112A/G12C)]、G13C[HRAS(V112A/G13C)]、Q61 R[HRAS(V112A/Q61R)]或3位点联合突变[HRAS(112A/G12 C/G13C/Q61R)],将HRAS(V112A)及上述突变基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),Western blot确证HRAS(V112A)及各突变体可体外表达后,每种质粒按每只100 μg剂量皮内注射6～8周龄雌性NIH小鼠,阴性对照组注射PBS,每组8只小鼠,持续观察小鼠致瘤情况.注射后4个月,取小鼠瘤样组织分别采用PCR和Western blot方法检测病变组织中的HRAS基因及其表达产物.结果:从DiFi细胞中成功扩增出含有V112A突变的HRAS(V112A)基因,并构建4个突变体,体外转染结果表明各HRAS均可在L929细胞中表达.重组质粒注射小鼠后,HRAS(V112A)组有4只小鼠注射后4个月于注射部位出现增生样改变,该病变在1个月后自愈;HRAS(V112A/Q61R)组有1只小鼠于注射后4个月出现明显的瘤样增生.至观察期末,HRAS(V112A/G12C)、HRAS(V112A/G13C)和HRAS(V112A/G12C/G13C/Q61R)组小鼠均未出现可见增生样结节.病变组织的PCR和Western blot检测结果表明HRAS(V112A)组小鼠增生样组织和HRAS(V112A/Q61R)组小鼠肿瘤组织中均有对应的HRAS基因存在和表达.结论:HRAS(V112A)可在NIH小鼠体内导致注射部位皮肤的增生样改变,含有Q61R突变的HRAS(V112A)可在NIH小鼠体内诱导肿瘤形成,含有G12C、G13C及G12C/G 13C/Q61R突变的HRAS(V112A)在小鼠体内不会引起明显病变.

目的 明确KRAS、NRAS、HRAS、BRAF、TERT基因在甲状腺细针穿刺标本中的表达特点,并评价这些基因对细胞学辅助诊断方面的应用价值.方法 回顾性研究中日友好医院病理科2019年3月至8月期间送检的甲状腺细针穿刺标本360例,每例标本均包含细胞涂片以及穿刺组织1管.涂片经95％乙醇固定后,行巴氏染色,细胞学结果依据Bethesda分级系统读片.另一瓶穿刺组织保存在生理盐水中,经核酸提取,并用实时定量PCR法进行基因检测.结果 标本无法诊断或不满意43例(11.94％),良性病变67例(18. 61％),意义不明确的细胞非典型病变或意义不明确的滤泡性病变37例(10. 28％),滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤17例(4.72％),可疑乳头状癌34例(9.44％),乳头状癌162例(45.00％).BRAF V600E突变166例(46.11％),KRAS 2号外显子突变1例(0.28％),NRAS3号外显子突变12例( 3. 33％), HRAS 3号外显子突变2例(0. 56％) ,TERT启动子突变3例(0.83％).其中NRAS突变伴有BRAF突变1例,TERT启动子突变3例均伴有BRAF突变.BRAF基因突变与患者细胞学诊断结果的相关性具有统计学意义(P＜0.05);TERT基因与性别及淋巴结转移与否的相关性具有统计学意义(P＜0.05);NRAS突变与细胞学诊断结果的相关性具有统计学意义(P＜0.05).结论 几种基因突变中,以BRAF基因突变最为常见,且对于辅助诊断的应用价值较高;在RAS基因中又以NRAS突变居多;而TERT启动子突变一般与BRAF基因突变伴随.

目的:探讨RAS蛋白家族在维持T-ALL细胞株体外生长中的功能.方法:纯化T-ALL细胞株DNA,利用PCR法扩增3个RAS基因(KRAS、NRAS、HRAS)的编码区.经T-A克隆后,Sanger法对KRAS、NRAS、HRAS基因编码区测序.将siRNA克隆到pSEH-361载体,在HEK-293T细胞中与pAMPHO和pVSVG 一起包装成逆转录病毒,随后感染T-ALL细胞.qRT-PCR和Western blot检测基因表达情况.利用Annexin V-PE/7-AAD染色T-ALL细胞,流式细胞术检测细胞凋亡情况.利用Hoechst 33258染色T-ALL细胞,流式细胞术检测细胞周期分布情况.经抗体染色,荧光显微镜观察cleaved-Caspase3蛋白的表达.结果:在T-ALL细胞株中,除Loucy和P12-ICH细胞KRAS基因发生c.6187G＞A(p.KRASG12D)突变,其余RAS基因均未发现错义突变.除PEER细胞(IC50=47.916 μmol/L)外,泛RAS抑制剂Compound 3144对其它T-ALL细胞均有一定杀伤作用.同样,除 PEER细胞(IC50=94.2265μmol/L)外,Tipifarnib可诱导多种T-ALL细胞凋亡.抑制KRAS表达后,T-ALL细胞凋亡明显,细胞周期阻滞.结论:KRAS蛋白维持T-ALL细胞株体外生长,是治疗T-ALL的潜在药物靶点.

目的:报道肺腺癌病例多基因检测的结果,分析肺腺癌驱动基因突变状态的相关因素.方法:回顾性总结武汉大学中南医院2017年1月至2021年7月肺腺癌检测EGFR、ALK、KRAS、HRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF、PTEN、AKT1、HER2、ROS1、RET等12个驱动基因突变的病例资料,探讨肺腺癌驱动基因突变状态的相关因素.结果:181例肺腺癌病例纳入研究,94例为穿刺活检标本,87例手术切除标本.81.21％(147/181)的病例存在驱动基因突变,3个主要突变是EGFR(60.8％,110/181)、KRAS(16.6％,30/181)、NRAS(2.2％,4/181).6例多基因突变,EGFR/NRAS、EGFR/KRAS、EGFR/PIK3CA、HER2/NRAS、HER2/PTEN 和 EGFR/KRAS/NRAS 各 1例.EGFR突变与女性(P＜0.001)和非吸烟(P＜0.001)相关,最常见的突变位点是Exon 19-del和Exon 21 L858R;KRAS突变与男性(P＜0.001)和吸烟(P＜0.001)相关,最常见的突变位点是Exon 2 G12C和Exon 2 G12V.穿刺标本与手术标本驱动基因突变阳性率无显著性差异(P＞0.05),早期(Ⅰ+Ⅱ)和晚期(Ⅲ+Ⅳ)肺腺癌基因突变阳性率无显著性差异(P＞0.05).结论:EGFR、KRAS基因突变状态与性别、吸烟状态相关,经皮肺穿刺活检与手术切除标本基因突变率无差异,早期和晚期肺腺癌基因突变率无差异.