目的 探讨非结构蛋白氨基酸突变(NS1-G53D、NS3-E250V)对登革病毒(Dengue virus,DENV)4型Ban 18HK20株增殖及毒力的影响.方法 通过与DENV减毒株(PDK53)进行序列比对,确定Ban18HK20株突变位点;采用同源重组技术构建点突变质粒pSPTM-Ban18HK20(G53D)、pSPTM-Ban18HK20(E250V)、pSPTM-Ban18HK20(G53D+E250V),酶切及基因测序鉴定点突变质粒;体外转录获得病毒RNA,电转染Vero细胞拯救获得点突变病毒;通过蚀斑试验、间接免疫荧光试验、病毒全基因组测序、生长动力学试验、CCK-8试验和小鼠神经毒力试验对点突变病毒进行生物学特性鉴定.结果 酶切及测序证实点突变质粒构建正确.免疫荧光试验及病毒测序结果显示病毒拯救成功.点突变病毒比母本病毒蚀斑小.Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(E250V)、Ban18HK20(G53D+E250V)的病毒滴度第4天达峰值,分别为7.67、7.84、7.78 LgPFU/mL;母本病毒第5天达峰值,为7.68 LgPFU/mLo Ban18HK20(G53D)感染的BHK21细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高(P=0.003 6);Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(G53D+E250V)感染的C6/36细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高(P＜0.000 1).点突变病毒与母本病毒对 4 周龄 BALB/c 小鼠均无神经毒力;点突变病毒 Ban 18HK20(E250V)(LD50=8.51 PFU)、Ban 18HK20(G53D+E250V)(LD5o=0.69 PFU)对3日龄BALB/c乳鼠的神经毒力低于母本病毒(LD50=0.69 PFU);等量病毒经脑内注射后,点突变病毒Ban18HK20(G53D+E250V)对裸鼠的存活率(60％)高于母本病毒(0).点突变病毒遗传稳定,在Vero细胞上传至第10代未出现回复突变.结论 非结构蛋白NS1-G53D氨基酸突变减弱了 Ban18HK20株对C6/36和BHK21细胞的毒性,双点联合突变可减弱Ban18HK20株在裸鼠体内的神经毒力.本研究为DENV毒力位点研究及疫苗研发奠定了基础.

在对长尖叶蔷薇和大花香水月季转录组测序的基础上,利用生物信息学方法,从其转录组数据中共获得23条MLO unigenes并对其进行了分析.结果显示它们之间的氨基酸数量、碱基数、分子量差异较小,多数为疏水性蛋白,平均亲水系数为-0.157 ～0.190,富含亮氨酸和丝氨酸.亚细胞定位主要分布于质膜中,包含5～9个跨膜结构;二级结构主要由α-螺旋组成.其中,等电点小于7的仅有1条,2条蛋白具有信号肽.这23条MLO蛋白具有15个长度在15～ 50个氨基酸间的保守基序.它们的系统进化关系分析结果揭示了MLO基因在长尖叶蔷薇与大花香水月季间具有较高的同源性和保守性.将这23条unigenes与来自于月季和拟南芥的MLO基因进行聚类分析,确定了6条可能参与抗白粉病的候选基因,对这6条候选基因进一步分析发现仅有2条unigenes符合MLO型白粉病基因的典型结构特征.最后,通过qRT-PCR试验验证,结果表明:这2条候选基因的相对表达量,在受到白粉病菌侵染后呈积极上调趋势.上述研究结果表明这2条候选基因很可能参与了寄主—白粉病菌的互作过程.

MLO 基因家族是一类重要的植物抗病基因,MLO 蛋白的突变体对白粉病真菌表现出广谱抗性,且能特异性调控细胞死亡,利用自发的细胞死亡来应答发育或非生物刺激.为了分析蔷薇科植物MLO 蛋白的结构特征、系统进化及潜在功能,本研究利用生物信息学方法对在GenBank 中已登录的来自于蔷薇科的7个物种共计82 条具有完整ORF 的MLO 基因进行了分析.分析显示这82 条蛋白的氨基酸数量、碱基数、分子量差异较小,平均亲水系数为-0.191～0.253,绝大多数具有内含子结构;亚细胞定位主要分布于质膜中,包含5～8个跨膜结构;共有15个保守基序,长度在15～50个氨基酸之间.其中,等电点小于7 的仅有1 条,6 条蛋白具有信号肽.系统进化关系揭示了这些物种间具有较高的同源性和保守性;将其与其它物种中已鉴定的 MLO 基因进行聚类分析,筛选出32个可能与抗白粉病相关的候选基因;进一步序列比对分析,发现仅有17 条基因具有MLO 型白粉病基因所有的典型结构.因此,本研究表明,所选用的82 条蔷薇科MLO 基因中,仅有17 条基因可能参与寄主- 白粉病菌的互作过程.本研究为进一步研究蔷薇科及其他植物MLO 基因的抗病遗传机制提供了一些参考依据.

Mildew resistance locus O(MLO)蛋白是植物特有的一类蛋白家族,其中的部分成员是白粉病菌成功侵染寄主植物的必要因子.一个或多个MLO基因的功能缺失突变可赋予植物对白粉病菌广谱且持久的抗性,mlo介导的白粉病抗性在抗病育种中发挥了重要作用.植物中的MLO蛋白可以分为7个亚家族,除了参与植物与白粉病菌的互作外,不同亚家族的MLO蛋白还有很多其他功能.本文对MLO蛋白的特征、分类、功能进行了归纳,介绍了植物与白粉病抗性相关的mlo突变体特征及抗病机制,并对MLO基因的功能、作用机理研究及其在植物抗病育种中利用应注意的问题进行了讨论.

目的 系统研究流体剪应力(fluid shear stress,FSS)作用下成骨分化方向不同阶段4种细胞内Piezo1离子通道蛋白的基因表达情况.方法 利用自行研发的锥板流动腔技术,对小鼠来源的间充质干细胞MSC、成骨样细胞MC3T3-E1、成骨末期细胞MLO-A5和骨细胞MLO-Y4施加不同强度FSS(0.1、1.1 Pa),并分别在0、0.5、1、3、6、12 h等不同时间点抽提细胞内总RNA,应用实时荧光定量PCR技术研究FSS刺激对Piezo1基因表达的影响情况.结果 MSC、MC3T3-E1、MLO-A5和MLO-Y4细胞内都表达Piezo1和Piezo2.FSS作用后,所有细胞的Piezo1表达明显升高,并且1.1Pa FSS刺激下的表达水平显著高于0.1 Pa.MSC、MC3T3-E1和MLO-A5这3种细胞在FSS刺激1h后,Piezo1表达水平达到最高.Piezo1表达依赖于细胞种类,其中MC3T3-E1细胞的表达量高于其他3种细胞.结论 Piezo1的表达与成骨分化过程、FSS水平和加载时间相关,研究结果对于揭示骨组织细胞内力学信号的传递机制以及发展相应临床治疗措施具有重要意义.

为研究MLO基因在烟草(Nicotiana tabacum)中的特性与功能,本研究采用同源克隆方法从烟草中克隆到NtMLO5a和NtMLO5b两个基因.序列分析表明,烟草NtMLO5a和NtMLO5b基因开放阅读框全长均是1 794 bp,均编码597个氨基酸的蛋白,相对分子质量均为68 kDa,等电点则分别为9.27和9.21.不同物种中MLO蛋白进化分析表明NtMLO5a和NtMLO5b蛋白与辣椒(Capsicum annuum)和野生番茄(Solanum pennellii)的MLO蛋白高度相似.实时荧光定量PCR结果显示,烟草‘K326’的NtMLO5a和NtMLO5b基因在根、茎、叶中均有表达,且在根中的表达水平最高,在花中只检测到NtMLO5b基因表达.白粉病、干旱和低温胁迫均提高了NtMLO5b基因的表达,接种白粉病48 h后和低温处理24 h后,NtMLO5b基因的表达量达到各自的最高值,分别为处理前的2.5倍和13.52倍;干旱处理后,NtMLO5b基因的表达持续上升,8 d后为处理前的7.54倍.白粉病和干旱对NtMLO5a基因表达量没有明显影响;低温处理12h后其表达量达到最大值,是处理前的13.72倍.

目的 通过体内外实验探究槲皮素对骨相关细胞衰老的影响,验证槲皮素通过抗骨相关细胞衰老作用对绝经后骨质疏松症的治疗作用.方法 选取小鼠骨细胞样细胞MLO-Y4及成骨细胞样细胞MC3T3-E1,构建体外压力诱导的成熟前衰老(stress induced premature senescence,SIPS)模型,通过qRT-PCR法和细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色确定细胞衰老样变化,利用CCK-8法确定槲皮素体外工作浓度,验证槲皮素在骨相关细胞SIPS中的作用.建立去势小鼠骨质疏松模型,槲皮素灌胃给药,与经典雌激素疗法相比较,利用micro-CT扫描分析骨参数及骨微结构的变化,并通过qPCR检测小鼠皮质骨内衰老相关基因p21、p53,衰老相关分泌表型(senescence associatedsecretory phenotype,SASP) TNF-α、IL-6以及破骨相关基因TRAP、CTSK和成骨相关基因OCN、RUNX2的表达情况.结果 体外实验证明槲皮素能有效抑制骨相关细胞SIPS样改变(P＜0.05).体内实验发现,给药12周后,相较对照组小鼠,槲皮素组小鼠股骨骨表面积与骨体积比值(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp)显著降低(P＜0.05),骨小梁数量(Tb.N)显著升高(P＜0.05),骨质疏松程度减轻,较雌激素疗法差异无统计学意义,并伴骨内SIPS相关基因p21、p53及SASP水平下调(P＜0.05),成骨水平不受明显抑制.结论 槲皮素可通过抑制细胞衰老挽救由雌激素缺乏导致的骨丢失;这可能成为绝经后骨质疏松症治疗的新手段.

目的 研究骨样细胞系MLO-Y4在不同强度静磁场下的生物学效应.方法 MLO-Y4细胞接受场强为500 nT亚磁场、0.2T中强磁场及16 T强磁场作用后,CCK8法检测细胞活性,HE染色分析细胞形态变化,实时定量PCR方法检测骨细胞功能相关基因的表达,ELISA或化学试剂盒检测骨细胞可溶性细胞因子的分泌,收集处理后的条件培养基诱导成骨细胞矿化及破骨细胞形成.结果 与对照组相比,亚磁场对骨细胞活性和形态无影响,促进了RANKL而抑制了Cx43的基因表达,促进了细胞因子M-CSF的分泌,其条件培养基对成骨细胞矿化无影响,但促进了破骨细胞形成.中强磁场对细胞活性无影响,增加了骨细胞突触数目,其条件培养基对成骨和破骨细胞分化都无明显影响.16 T强磁场促进了骨细胞活性及细胞突触数目,抑制了RANKL而促进iNOS和Cx43基因表达,促进ALP和NO而抑制M-CSF分泌,其条件培养基对成骨细胞矿化无影响,但抑制了破骨细胞形成.结论 骨细胞MLO-Y4在500 nT亚磁场下表现为负向的生物学效应,0.2T中强磁场下无明显生物学行为变化,而在16T强磁场下表现为积极的生物学效应.

为系统鉴定普通烟草(Nicotiana tabacum)基因组中白粉病感病基因NtMLO,通过构建已知拟南芥(Arabidopsis thaliana)和番茄(Solanum lycopersicum) MLO蛋白保守结构域的隐马尔可夫模型,获得烟草MLO家族候选序列共29个,对序列进行了基础理化性质、亚细胞定位和系统发育等分析.基础理化性质分析结果显示,NtMLO蛋白序列长度范围为479～605个氨基酸,理论等电点在7.02～9.50之间,富含碱性氨基酸,跨膜结构域数量为5～7个,亚细胞定位结果显示,该家族蛋白均定位于细胞膜上.通过对拟南芥、番茄、普通烟草、林烟草(N.sylvestris)和绒毛状烟草(N.tomentosiformis)等物种的共计90个MLO蛋白构建系统发育树,显示烟草中的MLO基因可分为5个亚组.通过定量PCR分析了不同亚组的19个NtMLO基因的组织表达特异性,发现除NtMLO3和NtMLO5两个基因在花中没有表达、NtMLO26叶中没有表达外,其余NtMLO基因在根、茎、叶片和花组织中均有表达.本研究为全面了解烟草基因组中MLO基因提供相关信息.

目的 建立稳定表达外源Dll1、Dll3、Dll4基因的MLO-Y4骨细胞株,研究骨细胞Notch信号Delta-like配体Dll1、Dll3、Dll4对骨髓基质细胞成骨分化的影响.方法 用过表达Dll1、Dll3、Dll4基因的重组慢病毒液感染MLO-Y4样骨细胞,嘌呤霉素筛选分别稳定表达Dll1、Dll3及Dll4基因的MLO-Y4骨细胞株.采用实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative,qPCR)对筛选出来的MLO-Y4骨细胞株中Dll1、Dll3及Dll4基因的表达进行鉴定.将3种细胞株分别与野生型小鼠骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)进行共培养,采用碱性磷酸酶(ALP)染色及ALP定量检测共培养3dALP活性变化;qPCR检测共培养3d成骨相关标志基因及Notch信号靶基因的表达水平,在使用Notch信号抑制剂DAPT后检测上述指标.结果 与阴性对照组相比,Dll1、Dll3及Dll4转染组中Dll1、Dll3及Dll4 mRNA的水平显著增加(P＜0.05).共培养3d后,骨细胞中Dll4基因的过表达促进了BMSC的ALP活性,与阴性对照组相比有统计学差异(P＜0.05).qPCR结果显示,MLO-Y4-Dll4组的ALP、Runx2、OPN及Collagen Ⅰ成骨相关标志基因的表达均有所升高(P＜0.05),Notch信号靶基因Hey1、HeyL、Hes1及Hes7的表达也有所升高(P＜0.05).而在加入DAPT后,MLO-Y4-Dll4组的ALP活性下降,成骨相关标志基因及Notch信号靶基因的表达有所下降(P＜0.05).结论 建立了稳定表达外源Dll1、Dll3或Dll4基因的MLO-Y4骨细胞株,在骨细胞中过表达Dll4能促进骨髓基质细胞的早期成骨分化,经典Notch信号通路在其中可能发挥了重要作用.