目的 通过在帕金森病模型中分析双特异性酪氨酸调控激酶1A(DYRK1A)与NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)激活的关系,探讨帕金森病中神经炎症的治疗靶点.方法 (1)采用MPP+处理BV2细胞(小鼠小胶质细胞)后,使用免疫印迹法(Western blot)检测DYRK1A及NLRP3蛋白的表达水平;加用DYRK1A抑制剂(Harmine)处理帕金森细胞模型,使用CCK8法检测小胶质细胞活性,免疫印迹法检测NLRP3蛋白表达水平.(2)MPTP慢性PD动物模型中,腹腔注射DYRK1A抑制剂(Harmine),免疫组织荧光观察小鼠中脑黑质区小胶质细胞数目,免疫印迹法检测小鼠中脑黑质区NLRP3蛋白表达水平.结果 (1)不同浓度MPP+处理小胶质细胞后,DYRK1A及NLRP3的蛋白水平较对照组均有升高(P＜0.05);Harmine(浓度为10、15 μmol/L)时可改善 MPP+对BV2细胞活性的损伤(P＜0.05);相比MPP+组,Harmine+MPP+组NLRP3蛋白水平明显下降(P＜0.05).(2)与对照组相比,模型组小鼠中脑黑质的小胶质细胞数量增多;与模型组相比,模型中浓度抑制剂组小鼠中脑黑质的小胶质细胞数量减少;模型组小鼠中脑黑质区NLRP3的蛋白水平较对照组升高,与模型组比较,模型中浓度及高浓度抑制剂组小鼠中脑黑质中NLRP3蛋白表达下降明显(P＜0.05).结论 抑制DYRK1A可减轻帕金森病模型中NLRP3炎症蛋白的激活,为帕金森病的治疗和研究提供新的思路.

目的 探讨霍山石斛多糖(DHP)对帕金森病(PD)小鼠运动障碍、神经元受损及星形胶质细胞衰老的改善作用.方法 将40只雄性C57BL/6小鼠随机分为NC组、MOD组、DHP100组、DHP350组,每组10只;MOD组、DHP100组、DHP350组腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD小鼠模型,DHP100组、DHP350组建模后分别灌胃给予100、350 mg/kg的DHP各0.5 mL,1次/天,连续2周.通过平衡木实验通过时间、悬挂实验悬挂时间、转棒实验停留时间评估各组运动能力,免疫荧光检测小鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)和星形胶质细胞核纤层蛋白B1(Lamin B1)荧光表达量,Western blotting法检测中脑Lamin B1、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)蛋白相对表达量,实时荧光定量PCR法检测中脑p16INK4a、基质金属蛋白酶3(MMP-3)mRNA相对表达量.将小鼠星形胶质细胞C8-D1A细胞分为三组,正常组用不含血清的DMEM培养液进行培养,模型组用0.6 mmol/L 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)作用24 h,DHP组用8 μg/mL DHP预处理12 h后加入0.6 mmol/L MPP+作用24 h.收集三组细胞培养基,作用于人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,比较SH-SY5Y细胞存活率及三组细胞周期比例、β-半乳糖苷酶(β-gal)阳性率、端粒酶表达.结果 与NC组比较,MOD组停留时间、悬挂时间及中脑TH阳性神经元数量、Lamin B1蛋白相对表达量均降低,通过时间延长,IL-1β、IL-6蛋白及p16INK4a、MMP-3 mRNA相对表达量均升高(P均＜0.05).与MOD组比较,DHP100组、DHP350组停留时间、悬挂时间及中脑TH阳性神经元数量、Lamin B1蛋白相对表达量均升高,通过时间、IL-1β蛋白及MMP-3 mRNA相对表达量均降低,且DHP350组停留时间、通过时间、IL-1β蛋白及MMP-3 mRNA相对表达量变化更明显(P均＜0.05).DHP350组IL-6蛋白及p16INK4a mRNA相对表达量均低于MOD组、DHP100组,MOD组小鼠中脑黑质星形胶质细胞中Lamin B1荧光表达量均低于NC组、DHP100组、DHP350组(P均＜0.05).加入正常组、DHP组、模型组细胞条件培养基的SH-SY5Y细胞存活率依次降低,两两比较P均＜0.05.与正常组比较,模型组G0/G1期细胞比例及β-gal阳性率升高,S期细胞比例及端粒酶表达降低(P均＜0.05);与模型组比较,DHP组G0/G1期细胞比例及β-gal阳性率降低,S期细胞比例及端粒酶表达升高(P均＜0.05).结论 DHP可以减轻PD小鼠的运动障碍,其机制可能与抑制星形胶质细胞衰老,从而减轻神经元损伤、发挥神经保护作用有关.

目的 探讨细胞周期依赖性激酶(Cdk)5抑制剂Roscovitine对1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)模型小鼠相关脑区病理变化的影响及可能机制.方法 经MPP+处理的细胞,采用Western blotting检测Roscovitine对P25、Cdk5蛋白的相对表达水平的影响;ELISA法检测Roscovitine对多巴胺的释放的影响.将15只雄性C57BL/6 N小鼠随机分为3组,分别为PBS组、MPTP组、MPTP+Roscovitine组,每组5只.MPTP组与MPTP+Roscovitine组从第3天起连续7 d腹腔注射25 mg/(kg·d)MPTP制备PD模型小鼠,MPTP+Roscovitine组连续10 d腹腔注射10mg/(kg·d)Roscovitine,PBS组给予等容量的PBS.末次给药24 h后,采用步态分析、旷场实验、转棒实验等检测Roscovitine对PD模型小鼠行为学的影响;采用免疫组织化学法检测Roscovitine对PD模型小鼠黑质、纹状体酪氨酸氢化酶(TH)及PD相关脑区的神经元、神经胶质细胞、神经炎症等相关指标表达的影响.结果 Western blotting和ELISA结果显示,经MPP+处理的细胞P25、Cdk5蛋白表达水平升高,多巴胺释放量相对降低(P＜0.01),Roscovitine可降低P25、Cdk5蛋白表达水平(P＜0.05)、增加多巴胺释放量(P＜0.05);与PBS组相比,MPTP组PD模型小鼠存在运动功能障碍,且黑质、纹状体内TH+细胞数下降(P＜0.01),PD相关脑区内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Iba1、核因子κB(NF-κB)抑制物激酶α(IKKα)、p-IKK阳性细胞数升高(P＜0.05);而Roscovitine干预显著改善了运动能力(P＜0.01),增加TH(P＜0.01)、降低GFAP、Iba1、IKKα、p-IKK(P＜0.05)的表达.结论 Roscovitine可减少MPTP模型小鼠PD相关脑区的多巴胺能神经元丢失和胶质细胞激活,抑制NF-κB信号通路激活,从而发挥神经保护作用.

OBJECTIVE To investigate the effects of pharmacological inhibition of STING by C-176,a STING selective inhibitor,in experimental model of Parkinson's disease.METHODS The acute and sub-acute mice mod-els of Parkinson's disease(PD)were established by in-traperitoneal injection of 1-methyl-4-(2′-methylphenyl)-1,2,3,6-tetrahydrophine(MPTP).The selective STING inhibitor C-176 was administered by intraperitoneal injec-tion.The potential neuroprotective effects of C-176 were evaluated by behavioral test,tyrosine hydroxylase(TH)immunostaining,Nissl staining,Western blotting,qPCR and immunofluorescence.For in vitro study,the effects of C-176 on LPS/MPP+-induced inflammatory responses in BV2 microglial cells were determined by real time RT-PCR and Western blotting analysis.RESULTS Our study revealed that C-176 significantly inhibited STING signaling activation,ameliorated MPTP-induced dopami-nergic neurotoxicity,motor deficit and associated neuroin-flammation.Furthermore,pharmacological inhibition of STING in BV2 microglia treated with LPS/MPP+ exhibited decreased inflammatory responses.More importantly,C176 also reduced NLRP3 inflammasome activation both in vitro and in vivo.CONCLUSION The results of our study suggest that pharmacologic inhibition of STING protects against neuroinflammation that may act at least in part through suppressing NLRP3 inflammasome acti-vation and thus ameliorated dopaminergic neurodegener-ation.STING signaling may holds great promise for the development of new treatment strategy for PD as an effective therapeutic target.

目的 NOD样受体热蛋白结构域3( NLRP3)-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 (caspase-1)炎症小体在1-甲基,4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠神经损伤中的作用及机制.方法 将小鼠随机分为模型组和对照组,模型组腹腔注射 MPTP 溶液(30 mg·kg-1·d-1),制备PD模型,对照组给予等量生理盐水;爬杆试验和悬挂试验观察小鼠行为学变化;免疫印迹试验(Western blot)检测小鼠中脑组织中炎症小体的含量.将体外培养的人源性神经母细胞SH-SY5Y随机分为对照组、无义组、siRNA NLRP3组、1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)组、siRNA+MPP+组;采用脂质体转染的方法,将siRNA-NLRP3转染至人源性神经母细胞SH-SY5Y中,加入MPP+孵育细胞48 h,体外观察NLRP3炎症小体对神经细胞的保护作用.噻唑蓝法(MTT)检测细胞活力的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western blot检测NLRP3、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)的蛋白质水平.结果 与对照组相比,模型组小鼠从木杆顶端爬至底端所耗时间显著增加(P<0. 05),悬挂得分显著降低(P<0. 05),中脑黑质部中NLRP3炎症小体、IL-1β、Pro-IL-1β以及caspase-1的表达量显著增加(P<0. 05).与MPP+组相比,体外转染siRNA-NLRP3的可显著降低 MPP+介导的 SH-SY5Y细胞中NLRP3蛋白的水平(P<0. 05),提高细胞的活力(P<0. 05),抑制其凋亡(P<0. 05),促进Bcl-2蛋白表达(P<0. 05),显著抑制cleaved caspase-3、Bax的蛋白表达.结论 NLRP3-caspase-1炎症小体在PD神经损伤过程中发挥重要作用;体外抑制NLRP3表达可显著增强SH-SY5Y细胞的活力,抑制其凋亡,可能通过调控线粒体凋亡信号通路对神经细胞发挥保护作用,为PD的临床治疗提供新的药物靶点.

目的 探讨抗氧化剂α-苯基-N-叔丁基硝酮( PBN)对MPP+/MPTP诱发帕金森病模型的神经保护作用.方法通过化学方法诱导自由基生成造成神经元损伤,分别在MPP+诱导损伤的细胞模型和MPTP诱导的动物模型中研究PBN的神经保护作用.结果 PBN对非细胞体系产生的自由基表现明显的清除作用,能明显抑制 MPP+诱导的 SH-SY5Y细胞内自由基生成,提高神经元的存活率.在 MPTP诱导的小鼠帕金森病模型中,PBN能明显提高黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性细胞数目,增加黑质致密部Nrf2和HO-1蛋白的表达,提高纹状体内 DA 及其代谢产物含量.结论PBN对MPP+/MPTP诱发帕金森病模型具有良好的神经保护作用.

目的 研究人参首乌提取物对帕金森病神经损伤的保护作用及其作用机制.方法 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶联用丙磺舒(MPTP/p)诱导建立帕金森病小鼠模型,使用不同剂量人参首乌提取物给药,免疫组织化学染色检测黑质致密区的酪氨酸羟化酶活性变化;1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)刺激损伤不同浓度人参首乌提取物预处理的SH-SY5Y细胞,MTT比色法检测细胞活力变化,荧光探针2',7 '-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)进行细胞活性氧检测.结果 人参首乌提取物能显著减少帕金森病小鼠大脑酪氨酸羟化酶活性神经元的丢失,抑制Mpp+引起的细胞活力下降和细胞内活性氧的产生.结论 结合前期药效学的研究结果,人参首乌提取物可通过抗氧化途径保护帕金森病所致的神经元损伤.

As an environmental risk factor,psychological stress may trigger the onset or accelerate the progression of Parkinson's disease (PD).Here,we evaluated the effects of acute restraint stress on striatal dopaminergic terminals and the brain metabolism of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP),which has been widely used for creating a mouse model of PD.Exposure to 2 h of restraint stress immediately after injection of a low dose of MPTP caused a severe loss of striatal dopaminergic terminals as indicated by decreases in the dopamine transporter protein and dopamine levels compared with MPTP administration alone.Both striatal 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+) and MPTP concentrations were significantly increased by the application of restraint stress.Striatal monoamine oxidase-B,which catalyzes the oxidation of MPTP to MPP+,was not changed by the restraint stress.Our results indicate that the enhanced striatal dopaminergic terminal loss in the stressed mice is associated with an increase in the transport of neurotoxin into the brain.

目的 探讨姜黄素是否通过激活自噬保护帕金森病(PD)多巴胺能(DA)神经元及其激活自噬的具体机制. 方法 采用1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(MPP+)处理人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型;同时采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射C57BL/6雄性小鼠建立PD动物模型;细胞及小鼠分别分为正常对照组、模型组、姜黄素组、姜黄素+3-MA组、3-MA组.姜黄素组、姜黄素+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组和3-MA组细胞在Mpp+处理的同时分别将姜黄素(40 μmol/L)、姜黄素(40 μmol/L)+3-MA(4 mmol/L)、3-MA(4 mmol/L)添加于培养基中孵育.姜黄素组、姜黄素+3-MA组、3-MA组小鼠在MPTP腹腔注射的同时分别予姜黄素(80mg/kg)、姜黄素(80 mg/kg)+3-MA(2 mg/kg)、3-MA(2 mg/kg)腹腔注射,1次/d.正常对照组同时腹腔注射无菌生理盐水(30 mL/kg).各组细胞在药物处理48 h后分别进行酪氨酸羟化酶(TH)免疫荧光染色.采用Western blotting实验检测α-突触核蛋白(α-Syn)、自噬相关蛋白溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)和微管相关蛋白1轻链3(LC3)的蛋白表达,并分离核浆蛋白测定核转录因子EB(TFEB)蛋白在胞浆和胞核中的表达;采用RT-PCR检测α-Syn mRNA表达.各组小鼠在最后1次药物注射后14d时处死取中脑黑质脑组织行TH免疫组化染色.采用Western blotting实验检测α-Syn和LC3的蛋白表达. 结果 (1)与模型组比较,姜黄素组细胞和小鼠中脑黑质TH阳性细胞数目增多(即DA神经元存活数目增多),细胞内α-Syn蛋白及mRNA表达减少,小鼠中脑α-Syn蛋白表达减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).同时,姜黄素组细胞内自噬蛋白LAMP2A和LC3-Ⅱ表达增加,小鼠中脑LC3-Ⅱ蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).(2)与姜黄素组比较,姜黄素+3-MA组细胞及小鼠中脑黑质DA神经元存活数目减少,细胞内α-Syn蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)与模型组比较,姜黄素组细胞胞核内TFEB表达显著增加,姜黄素+3-MA组细胞胞浆TFEB表达显著增加,胞核表达显著减少,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 姜黄素具有保护DA神经元功能,激活细胞自噬功能从而促进α-Syn的自噬性清除是其主要作用机制之一,增加TFEB表达、促进TFEB向细胞核内转移行使转录功能继而促进自噬溶酶体合成可能是其激活细胞自噬功能的主要途径.

Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder characterized by the selective loss of dopaminergic neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc).Although the pathogenic mechanism underlying PD remains largely unknown,decreased nigral glutathione (GSH) in postmortem brains of PD patients supports the presence of oxidative stress in PD.We found that Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH),which is important for maintaining the level of GSH,protected dopaminergic (DA) neurons from neurotoxicity of MPTP/MPP+.In the present study,NADPH prevented DA neurons from MPTP toxicity with increased GSH and decreased reactive oxygen species (ROS) levels in the ventral midbrain of mice,and improved motor activity.Our present results demonstrated that NADPH inhibited the phosphorylation of p38MAPK,decreased the level of TP53 protein,and inhibited TP53 nuclear translocation in DA neurons of SNpc and in MES23.5 cells.Furthermore,NADPH decreased the protein level of TP53 target gene,Bax,cleavage of PARP,and nuclei condensation.Taken together,NADPH abrogated MPTP-induced p38MAPK phosphorylation,TP53 nuclear translocation,and Bax induction,and finally,MPTP/MPP+-induced apoptosis of DA neurons.This study suggests that NADPH may be a novel therapeutic candidate for PD.