目的:从人尿道上皮细胞(SV-HUC-1)T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白.方法:以原核表达、纯化的重组生殖支原体黏附蛋白(rMgPa)为靶分子,对人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库进行4轮生物淘选,采用T7特异性引物扩增阳性克隆的插入片段,PCR产物测序后进行BLAST分析,间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot检测阳性噬菌体与rMgPa的特异结合.结果:经过4轮生物淘选,噬菌体克隆富集明显;DNA测序后经BLAST比对分析,结果表明随机挑取的32个阳性克隆包括7种不同序列,其中以RPL35重复次数最多;间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot结果表明7个代表性噬菌体均能与rMgPa特异结合.结论:60S核糖体蛋白L35(RPL35)可能是MgPa的互作蛋白,为深入了解MgPa的生物学功能以及生殖支原体的致病机制奠定了实验基础.

从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白.以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆.检测阳性克隆LacZ报告基因的活性.提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析.结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa.用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞.经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白.从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白,为阐明MgPa的功能及Mg可能的致病机制提供参考.

目的 建立生殖支原体巢式-荧光定量PCR快速检测技术.方法 针对生殖支原体MgPa基因的保守片段(1 414 ～1 561bp),利用Primer express 3.0设计引物及探针,巢式PCR扩增临床样本,纯化后克隆到载体,制备阳性标准品.优化PCR反应条件,研究其特异性、灵敏性和重现性. 结果 构建了含MgPa基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在101 ～ 109拷贝数之间有较好的线性关系.该方法检测阳性率高达15.4％,能特异性检测生殖支原体,而人型支原体、解脲脲原体、沙眼衣原体等检测为阴性;灵敏度高,可检测到10个拷贝数;3组重复试验的变异系数均小于3％.结论 本研究建立了生殖支原体的快速检测技术,具有检测阳性率高、特异性强、灵敏度高、重现性好等特点.

具有致病性的生殖支原体(Mg)生长缓慢,不易培养,而血清学诊断与肺炎支原体又有交叉反应,这给Mg的临床诊断带来困难。为了进一步解决Mg的临床检测问题,本研究采用Mg粘附因子基因序列合成一对引物MgPa-1和MgPa-3,用聚合酶链反应(PCR)方法检测Mg.结果表明,对Mg能产生特异性扩增,片段大小为281bp,而对肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、沙眼衣原体及淋球菌等则不能扩增出任何片段。作者认为,PCR为一种高度特异和敏感性的方法,它为Mg的临床检测提供了重要的手段。我们还对引物浓度、退火温度及模板量对PCR扩增结果的影响进行了初步探讨。

观察培哚普利（perindopril）对链脲霉素诱导的糖尿病（DM）大鼠肾脏的保护作用。DM对照组（DC组）每日注射长效胰岛素，DM治疗组（DP组）并每天给予培哚普利1mg/kg。于病程1、3、6个月测24小时尿蛋白。取肾脏作光镜和电镜检查，测定肾小球平均截面积（MGPA）和肾小球平均体积（MGV）。结果显示6个月期间DC、DP组尿蛋白定量明显高于NC组（ P<0.01），且DC组高于DP组（ P<0.05）。3、6个月时DC、DP组MGPA、MGV均大于NC组，6个月时DP组小于DC组。电镜观察表明，DM大鼠系膜区扩张，足突融合，基底膜增厚等，但DP改变较轻。提示DM大鼠存在肾脏结构和功能异常；培哚普利对肾脏有保护作用。

目的 运用生物信息学软件预测生殖支原体P110蛋白的结构和功能.方法 从NCBI数据库中下载P110的氨基酸序列,通过ProtParam和ProtScale在线工具对蛋白的理化性质、亲疏水性质进行分析;利用SignalP-5.0和TMpred及Phobius分析该蛋白的信号肽和跨膜蛋白结构域;利用NetNGlyc 1.0 Server和NetPhos 3.1 Server软件预测蛋白质糖基化位点和磷酸化位点;采用在线软件SOPMA分析蛋白的二级结构,利用SWISS-MODEL软件建立蛋白的三级结构模型;利用ABCpred和SYF-PEITHI Hla-a*0201预测蛋白的B细胞抗原表位和T细胞抗原表位;使用STRING在线软件及NCBI中的BLAST工具对相互作用蛋白进行分析.结果 P110蛋白的相对分子质量为114.44782×103,由1053个氨基酸组成,理论等电点为7.6,分子式为C5095 H7952 N1354 O1624 S9,为稳定的亲水性蛋白.该蛋白含有跨膜结构域且有信号肽,可能属于分泌蛋白.该蛋白含有12个糖基化位点和153个磷酸化位点,二级结构预测主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,分别占24.41％和45.77％.P110蛋白含有94个B细胞抗原表位和23个T细胞抗原表位,该蛋白P110可能与MGPA、HMW2和P32等10个蛋白存在相互作用关系.结论 生殖支原体P110蛋白为亲水性分泌蛋白,具有潜在的B/T细胞抗原表位,可作为研发新型靶向药物的候选蛋白.

目的 ·探究乳腺癌脑转移患者的临床病理特征、预后情况及可能的影响因素.方法 ·选择2007年1月—2021年12月于上海交通大学医学院附属仁济医院收治的女性乳腺癌脑转移患者75例.通过临床电子病历收集患者的临床病理特征,并于随访期间收集患者的脑转移后总生存期(overall survival after brain metastases,OSBM).采用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC curve,ROC曲线)评估各项生化指标对OSBM的预测效能.采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同临床病理特征与患者OSBM的相关性,并在此基础上对具有统计学意义的因素进一步行Cox比例风险回归分析,以确定独立影响因素.结果 ·75例患者的OSBM为11.0(5.0,24.0)个月.ROC曲线的结果显示,糖类抗原125(carbohydrate antigen125,CA125)对OSBM具有较好的预测效果,其最佳截断值为22.3 U/mL.Kaplan-Meier生存分析的结果显示,初发转移为脑转移(P=0.046)、脑转移治疗期间颅外病灶发生进展(P=0.042)、脑转移灶仅累及小脑幕一侧(P=0.013)、CA125水平<22.3 U/mL(P=0.000)、接受过局部治疗(P=0.034)改良分级预后评估(modified Graded Prognostic Assessment,mGPA)>1分(P=0.001)的患者的OSBM更长.Cox比例风险回归分析显示,脑转移灶同时累及小脑幕两侧或累及脑膜(P=0.029)、CA125水平≥22.3 U/mL(P=0.005)为OSBM的危险因素,mGPA>1分(P=0.033)为其保护因素.结论 ·乳腺癌脑转移灶的位置、确诊脑转移时患者的CA125水平以及mGPA评分是影响预后的重要因素.