目的:通过酵母双杂交实验筛选与环指蛋白216(ring finger protein 216, RNF216)相互作用的蛋白，进一步阐明RNF216在GnRH缺陷疾病中的作用。方法:构建pGBKT7- RNF216重组表达载体，将其转化到Y2HGold酵母中，与人cDNA文库进行杂交，筛选与RNF216相互作用的蛋白，然后在Y2HGold酵母中进行验证。 结果:成功构建了pGBKT7- RNF216重组表达载体，并在Y2HGold酵母中成功表达；通过酵母双杂交实验，筛选到了一个与RNF216相互作用的蛋白——丝状蛋白B(filamin B, FLNB)，并在Y2HGold酵母中验证了它们之间的相互作用。 结论:成功筛选到一个与RNF216相互作用的FLNB蛋白，RNF216可能通过调节FLNB或FLNB/FLNA异源二聚体影响GnRH神经元的增殖和迁移。

目的:筛选含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1(WWP1)相互作用蛋白，探讨WWP1和依托泊苷诱导蛋白24(EI24)对肝癌细胞增殖的影响。方法:利用酵母双杂交的方法筛选与WWP1相互作用的蛋白，并利用免疫共沉淀来进行相互作用验证。通过体内泛素化实验验证泛素连接酶WWP1与EI24酶和底物的关系。以慢病毒感染的方法建立WWP1和EI24稳定过表达或敲低表达的肝癌细胞系。通过细胞增殖实验、平板克隆实验和裸鼠成瘤实验检测WWP1和EI24对肝癌细胞增殖的影响。结果:WWP1可以与底物EI24相互作用，并能够在体内将EI24泛素化降解。成功构建稳定过表达或敲低表达的WWP1和EI24的肝癌细胞系HepG2。在HepG2细胞中，过表达WWP1可以降低内源EI24的蛋白水平，而敲低WWP1可以使EI24蛋白水平增加。细胞计数盒8(CCK-8)法检测结果表明，在36 h时，WWP1过表达组和shWWP1组细胞的相对增殖活性分别为(347.00±8.15)%和(187.08±4.86)%，与对照组(270.33±15.01)%比较，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。在36 h时，EI24过表达组和shEI24组细胞的增殖活性分别为(183.75±8.11)%和(317.33±9.60)%，与对照组(270.33±15.01)%比较，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。克隆形成实验结果显示，对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的克隆形成数分别为(52±7)个/视野、(76±4)个/视野和(19±3)个/视野，WWP1过表达组细胞克隆形成明显增多( P<0.05)，而敲低WWP1后细胞克隆形成较对照组减少( P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的克隆形成数分别为(38±4)个/视野、(10±3)个/视野和(69±7)个/视野。与对照组比较，过表达EI24使细胞克隆形成明显减少( P<0.05)，敲低EI24的表达使细胞克隆形成明显增多( P<0.05)。裸鼠体内实验结果显示，经过4周同等条件喂养后，对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 400.00±43.71)mm 3、(2 636.67±290.45)mm 3和(642.17±36.00)mm 3，差异均有统计学意义( P<0.05)。对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.23±0.08)g、(2.05±0.17)g和(0.88±0.09)g，差异均有统计学意义( P<0.05)。WWP1过表达组细胞成瘤能力明显增强，shWWP1组成瘤能力明显减弱。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 245.17±93.10)mm 3、(662.17±60.88)mm 3和(1 986.67±226.75)mm 3，差异有统计学意义( P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.15±0.04) g、(0.85±0.02)g和(1.73±0.05)g，差异有统计学意义( P<0.05)。EI24过表达组细胞成瘤能力明显减弱，shEI24组成瘤能力明显增强。 结论:WWP1可以靶向底物EI24进行泛素化降解，并促进肝癌细胞的增殖。

弱精子症是一种精子运动活力不足的病症，约有27.8%的男性不育由弱精子症导致，其病因复杂，发病机制尚不明确，探讨其发病机制有助于寻找有效预防和治疗策略。近年来，随着蛋白质组学技术（双向电泳、酵母双杂交技术、质谱等技术）的发展，众多研究者将研究重点放在基于蛋白质组学的弱精子症研究上，揭示了弱精子症差异蛋白及所在生物通路，为弱精子症的机制研究提供了众多理论支撑。本文围绕蛋白质组学的相关技术，对弱精子症的差异蛋白表达、病因和发生机制等方面取得的诸多成果进行综述，希望为弱精子症的诊治提供新思路。蛋白质间的相互作用和通路及代谢异常为研究弱精子症的精子运动活力提供了一个很有潜力的方向。

目的:鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法:通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid，Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白；通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰；通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点；通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果:酵母双杂交和基因测序结果表明，SseK3的一个全新底物是Snapin；SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin；修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸；Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论:本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin，初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响，为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。

减数分裂特异性调控分子Moa1定位到着丝粒受到动粒蛋白CENP-C的调控,同时Moa1参与黏连蛋白Rec8介导的着丝粒区域姐妹染色单体的黏连.为了研究这些蛋白质之间的相互作用,本研究利用酵母双杂交实验(yeast two-hybrid assay)测定分析了 Moa1和CENP-C、Rec 8之间的相互作用,并通过在Moa1中定点突变鉴定了与CENP-C和Rec8相互作用所需的一些氨基酸残基.实验结果表明,Moa1和CENP-C的相互作用对于Moa1参与调节姐妹动粒的单极附着很重要.然而,双杂交实验中与Rec8相互作用所需的Moa1的S143和T150突变没有显示出Moa1或Rec8功能的显著缺陷.这表明氨基酸残基的突变可能不足以干扰体内Moa1和Rec8之间的相互作用,需要进一步的研究来确定Moa1和Rec8的相互作用域.本研究揭示了影响减数分裂同源染色体分离的Moa1氨基酸位点,为减数分裂的染色体分离机制提供更深入的理解.

AP3/DEF(APETALA3/DEFICIENS)基因为MADS-box基因家族的B类基因,在花发育过程中主要参与调控花瓣和雄蕊发育.对盐肤木(Rhus chinensis)AP3/DEF同源基因进行克隆及功能分析,有助于探究其在盐肤木雄蕊发育过程中的作用.采用RT-PCR技术获得盐肤木AP3/DEF同源基因CDS;利用NCBI CD Search对其序列和结构域进行比较分析;利用酵母双杂交系统,对AP3/DEF同源蛋白与盐肤木中其它MADS-box转录因子进行蛋白互作验证;通过实时荧光定量PCR分析盐肤木AP3/DEF同源基因的时空表达模式;用过表达拟南芥(Arabidopsis thaliana)验证盐肤木AP3/DEF同源基因在花器官发育中的功能.结果表明,克隆得到2个盐肤木AP3/DEF同源基因分别命名为RcAP3(GenBank:OR962160)和RcTM6(GenBank:OR962159),根据其氨基酸保守结构域比对及系统进化分析,发现这2个蛋白序列与漆树科的芒果(Mangifera indica)和阿月浑子(Pistacia vera)AP3/DEF同源蛋白亲缘关系最近.酵母双杂交结果表明,RcAP3和RcTM6与盐肤木B类蛋白RcPI、C类蛋白RcAG和Rcag存在互作关系,但与A类和E类蛋白不存在互作关系.实时荧光定量PCR分析结果显示,RcAP3和RcTM6基因在不同性别盐肤木花芽快速发育期高表达,在花芽发育早期和开花后表达水平较低;RcAP3在雌花、雄花和两性花的花芽分化过程中均维持较高的表达水平,而RcTM6在两性花中显著表达,在雄花和雌花中表达量很低.两性花快速生长期,RcAP3在花瓣和雄蕊中高表达且差异很小,而RcTM6在雄蕊中的表达量显著高于其它花器官.RcAP3基因能恢复拟南芥ap3-3突变体花瓣和雄蕊的缺陷表型,RcTM6过表达则导致拟南芥花瓣、雄蕊和子房缩短,花药败育,表明盐肤木中同属AP3/DEF亚家族的同源基因RcAP3和RcTM6存在功能分化.RcAP3促进花瓣和雄蕊发育,而RcTM6抑制雄蕊发育.研究结果为进一步研究盐肤木性别分化的分子机制奠定了基础.

钙离子(Ca2+)/钙调素(calmodulin,CaM)信号参与植物生长发育和对外界刺激响应的调节.拟南芥(Arabidopsis thaliana)CaM家族共有 7 个基因,编码的蛋白质氨基酸序列具有高度保守性.该研究通过酵母双杂交及生物信息学分析等方法,对CaM5的2个剪接体CaM5.1和CaM5.3进行蛋白结合活性分析.结果表明,拟南芥钙调素结合蛋白(calmodulin-binding protein,CaMBP)IQM3(IQ motif-containing protein 3)能在酵母中与除CaM5.3 外的CaM家族的成员结合.生物信息学分析表明,CaM5.3比CaM5.1和其他CaM亚型成员多出1个由35个氨基酸残基组成的C-末端序列(C-terminal domain,CTD),可能影响CaM5.3与IQM3结合.在CaM5.1的C-末端添加CML10 的CTD,将重组蛋白与IQM3进行结合,证实CaM5.3的CTD是影响其与IQM3结合的关键序列.因此,拟南芥CaM5的不同剪接方式影响其蛋白结合活性,为研究钙调素及钙调素结合蛋白的结合活性提供参考.

为探究胰岛素样促雄性腺激素(Insulin-like androgenic hormone,IAG)在甲壳动物性别分化过程作用的分子调控途径,挖掘与IAG蛋白存在互作关系的候选蛋白信息,研究使用红螯螯虾促雄性腺及输精管组织构建核体系酵母文库,利用酵母双杂交技术筛选与IAG互作的候选蛋白,并对关键候选蛋白的编码基因进行克隆与表达分析.获得初级文库容量为1.12×107,次级文库容量为1.28×107;成功筛选到25个阳性克隆,共注释到12个蛋白编码基因;克隆获得关键候选蛋白的编码基因muc5acl(Mucin-5AC-like)的CDS全长474 bp;半定量与荧光定量表达结果表明,muc5acl在红螯螯虾的促雄性腺、精巢及输精管中特异表达,且在雄性个体促雄性腺中的表达水平显著高于间性,在输精管中的表达则相反,推测该基因可能参与雄性激素的分泌及精子运输过程,并与间性红螯螯虾的性腺发育有关.研究结果将为进一步解析IAG调控红螯螯虾间性性别形成的分子机制提供重要信息.

[目的]筛选玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)转录因子的互作蛋白,解析黑色素调控转录因子StMR1 调控玉米大斑病菌致病性的分子机制.为解析玉米大斑病菌侵染过程中转录因子的调控网络,阐明病菌的致病机理提供参考.[方法]收集玉米大斑病菌菌丝和孢子不同萌发阶段作为试验材料,采用Gateway方法构建玉米大斑病菌cDNA文库,使用同源重组的方法构建转录因子StMR1 的诱饵载体,采用酵母双杂交技术筛选其互作蛋白并进行一对一验证.[结果]构建的玉米大斑病菌文库插入的平均片段长度大于 1 000 bp,初级文库及次级文库的库容量为 1.2×107 和 1.04×107 CFU,重组率为 100%,可以用于酵母双杂交筛选.成功构建可以用于筛库的诱饵载体pGBKT7-StMR1,经初筛与复筛得到 3 个互作蛋白,一对一验证短链脱氢酶、糖基转移酶、富含亮氨酸重复序列蛋白均与转录因子StMR1 存在互作.[结论]成功构建了丰富度高且质量好的玉米大斑病菌cDNA文库并筛选到了与转录因子StMR1 互作的蛋白.

薄荷作为药食同源植物,具有重要经济价值.茉莉酸信号抑制子JAZ蛋白在调节植物应答逆境胁迫方面具有重要作用.克隆薄荷MeJAZ8基因,并分析其蛋白特征、蛋白互作和表达模式,为薄荷抗逆分子育种提供基因资源.该实验将通过生物信息学、酵母双杂交、烟草叶片瞬时表达、qRT-PCR等技术对McJAZ8的蛋白结构特征、亚细胞定位、蛋白互作与基因表达进行分析.结果显示:①McJAZ8基因全长543 bp,编码180个氨基酸,McJAZ8蛋白具有保守的TIFY和Jas结构域,与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2同源性较高.②McJAZ8蛋白定位于细胞核和细胞质.③酵母双杂交结果显示,McJAZ8与其自身或Mc-JAZ1/3/4/5蛋白互作形成同源或异源二聚体.④McJAZ8在不同组织中均有表达,幼叶中表达量最高.在叶序中,McJAZ8在第4片叶中表达量最高,而第2片叶中表达量最低.⑤在叶片和根中,McJAZ8在茉莉酸甲酯(MeJA)、干旱、NaCl处理下的表达呈不同程度地上调;McJAZ8的表达在CdCl2处理下呈先上调而后下调的模式;在叶片中,McJAZ8的表达在CuCl2处理下呈逐渐下调的趋势,而在根中呈先下调后上调再下调的趋势;在叶片和根中,MeJAZ8在A1C13处理下的表达均呈不同程度的下调.该研究丰富了薄荷中茉莉酸信号抑制子JAZ基因的研究,并为薄荷分子育种提供了基因资源.