目的 构建人源自噬微管相关蛋白轻链3A(microtubule-autophagy-related protein 1 light chain 3 A,mRFP-C1-LC3A)过表达质粒,并观察其在氯化钴(CoCl2)诱导的大鼠心肌细胞(H9C2细胞)缺氧模型中表达及抗凋亡机制.方法 利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术以cDNA文库为模板克隆人源轻链3A(light chain 3A,LC3A)基因,构建mRFP-C1-LC3A过表达质粒.通过0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2细胞,构建大鼠心肌细胞缺氧模型.应用Western-blot以及荧光成像技术检测细胞缺氧模型中的线粒体自噬水平的变化.通过Western-blot检测H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平不同对凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl2)、胱天蛋白酶3(caspase-3)表达的影响.结果 质粒酶切、测序结果及Western-blot实验证明mRFP-C1-LC3A真核表达载体构建成功.Western-blot结果表明经 0.8 mmol/L CoCl2 处理H9C2 细胞后,细胞内低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF1α)蛋白表达上调、Hoechst/碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色证实心肌细胞凋亡比例增加,缺氧模型构建成功(P<0.05).结合Western-blot以及荧光成像结果显示在H9C2细胞缺氧模型中线粒体自噬水平明显升高(P<0.05).通过巴佛洛霉素A1(BafA1)抑制线粒体自噬后,凋亡相关蛋白Bcl2表达下降、活化caspase-3表达升高,表明抑制线粒体自噬后,细胞凋亡水平进一步升高(P<0.05),Hoechst染色进一步明确结论.结论 成功构建人源LC3相关表达载体,并证实线粒体自噬可以抑制心肌细胞缺氧模型中的细胞凋亡.

单细胞转录组测序(scRNA-seq)是一种在细胞水平观测单个细胞之间转录组差异的新兴技术，其基本策略是捕获单细胞，经裂解得到微量mRNA，逆转录后扩增，cDNA用于制备测序文库。目前该技术已被广泛应用于多个学科领域。视觉神经系统在结构上包括视网膜、外侧膝状体及视皮层等，负责视觉信息的获取和处理，进而形成视觉。视觉信息占全部感觉信息的70%以上，故对视觉神经系统的研究显得尤为重要。随着科学技术的快速发展，单细胞转录组测序技术的研究成果也越来越多，该技术正逐渐成为指导临床实践的重要工具，为基础研究向临床转化搭建了桥梁。本文介绍单细胞转录组测序技术的主要技术路线和方法，并详述其在视觉系统研究中的应用。

目的:在哺乳动物细胞内基于线性双链DNA"与门"基因线路构建纳米抗体文库。方法:应用基于线性双链DNA的"与门"逻辑基因线路构建纳米抗体文库，首先通过PCR扩增将互补决定区（CDR）随机序列引入上、下游线性双链DNA，将其共转染至HEK293T细胞，转染48 h后，经RNA提取、cDNA合成、PCR扩增、高通量测序和数据处理步骤，鉴定"与门"形成的纳米抗体文库序列，对本策略进行了分析与评价。结果:深度测序共测得4 173 356条序列，其中约88.18%的序列为纳米抗体文库序列。文库核酸序列最丰富的序列长度为264 bp，为理论设计长度。后续在264 bp序列中鉴定出22 172种纳米抗体序列，且CDR1~3序列中的核苷酸频率符合NNK模式。结论:本研究开发了一种基于线性双链DNA"与门"逻辑基因线路在哺乳动物细胞中构建纳米抗体文库的新方法。

胎盘生长因子（PLGF）是从人胎盘互补DNA（cDNA）文库中分离纯化而得，合体滋养层细胞为其主要合成部位。PLGF可与位于滋养层细胞和血管内皮细胞的酪氨酸酶受体结合，分别通过自分泌调节滋养层细胞增殖和旁分泌调节血管新生。PLGF对孕产妇妊娠过程中胎盘的形成和发育具有极为重要的作用，其分泌异常与妊娠并发症（如妊娠合并糖尿病、妊娠期高血压疾病、子痫前期等）的发生、进展关系密切。对PLGF的结构、受体、生物活性及其与正常妊娠、妊娠并发症的关系作一综述，为妊娠并发症的临床指导及辅助诊断提供参考。

目的:通过酵母双杂交实验筛选与环指蛋白216(ring finger protein 216, RNF216)相互作用的蛋白，进一步阐明RNF216在GnRH缺陷疾病中的作用。方法:构建pGBKT7- RNF216重组表达载体，将其转化到Y2HGold酵母中，与人cDNA文库进行杂交，筛选与RNF216相互作用的蛋白，然后在Y2HGold酵母中进行验证。 结果:成功构建了pGBKT7- RNF216重组表达载体，并在Y2HGold酵母中成功表达；通过酵母双杂交实验，筛选到了一个与RNF216相互作用的蛋白——丝状蛋白B(filamin B, FLNB)，并在Y2HGold酵母中验证了它们之间的相互作用。 结论:成功筛选到一个与RNF216相互作用的FLNB蛋白，RNF216可能通过调节FLNB或FLNB/FLNA异源二聚体影响GnRH神经元的增殖和迁移。

目的:分析人正常宫颈上皮细胞(HcerEpic)感染沙眼衣原体( Chlamydia trachomatis, Ct)前后基因表达谱差异。 方法:HcerEpic细胞经DEAE-D预处理后加入E型 Ct标准株，培养44 h后收集HcerEpic细胞(感染组)，并以未感染 Ct的HcerEpic细胞作为对照组，提取两组总RNA后反转录并构建cDNA文库。通过高通量测序分析两组基因表达谱差异，并选择代表性基因通过实时荧光定量PCR(qPCR)验证。 结果:共检测23 997个基因，差异基因125个，其中上调基因119个，下调基因6个；GO分析显示差异基因富集于对病毒防御反应、Ⅰ型干扰素(interferon，IFN)信号通路、对Ⅰ型IFN的细胞反应等条目；KEGG富集通路为甲型流感、单纯疱疹病毒感染、EB病毒感染、HPV感染、NOD样受体通路等相关通路。结论:人正常宫颈上皮细胞感染 Ct前后转录组存在差异，差异基因主要富集于IFN通路，与细胞抗病毒过程密切相关。qPCR验证了ISG15、IFIT2、OASL、UBE2L6等差异显著且与IFN通路密切相关的基因。

目的:构建自发性早产产妇胎盘与足月产妇胎盘差异表达基因cDNA文库，初步分析自发性早产可能的分子机制。方法:选取50例足月健康产妇胎盘和50例自发性早产产妇胎盘组织，提取胎盘组织总RNA，采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)技术构建相应的cDNA差减文库，进行克隆测序，所得结果通过Blast软件与Genbank中的已知核苷酸序列进行查询和同源性比对，分析可能和早产发生相关的分子机制。结果:从正向及反向文库中随机挑选出200个克隆，进一步筛选出80个差异表达基因片段。生物信息学方法分析显示，两组差异表达基因功能涉及先天免疫、炎症、激素调节、营养代谢、应激及凋亡等方面。结论:早产产妇胎盘组织中存在与先天免疫、炎症、激素调节、营养代谢、应激及凋亡等相关的基因表达变化，其中 GGT2基因很可能是1个新的导致自发性早产发生的基因，其具体调控机制有待进一步深入研究。

目的:鉴定SseK3蛋白宿主中新的生物学底物以及对其功能的影响。方法:通过酵母双杂交系统(yeast-two-hybrid，Y2H)从HeLa cDNA文库中筛选SseK3潜在结合蛋白；通过细胞共表达和体外活性试验检测SseK3对底物蛋白的精氨酸N-乙酰葡萄糖胺化(Arg-GlcNAc)修饰；通过点突变检测SseK3对底物蛋白的修饰位点；通过免疫共沉淀试验检测底物蛋白的Arg-GlcNAc修饰对其互作蛋白结合能力的影响。结果:酵母双杂交和基因测序结果表明，SseK3的一个全新底物是Snapin；SseK3在细胞内和体外均可以Arg-GlcNAc修饰Snapin；修饰位点位于Snapin蛋白C端的119和120位精氨酸；Arg-GlcNAc修饰Snapin抑制了Snapin-SNAP25的结合。结论:本研究成功筛选到SseK3的一个新的宿主底物蛋白Snapin，初步研究了SseK3对Snapin的Arg-GlcNAc修饰及该修饰对Snapin功能的影响，为后续进一步理解细菌的Arg-GlcNAc修饰功能以及在病原微生物感染过程中的作用机制提供理论依据。

目的 探讨转运RNA衍生的小RNA(transfer RNA-derived small RNA,tsRNA)在急性心肌梗死(AMI)早期诊断中的价值及其作为AMI诊断标志物的潜能.方法 将年龄及体质量匹配的雄性C57小鼠(8～10周龄)随机分为MI组及对照组(Sham组),每组4只.两组均于建模24 h后提取左室心肌组织RNA,经去修饰预处理,连接人工化接头后扩增,筛选包含15～40个核苷酸的小RNA扩增产物,构建文库并测序,将测序结果与GtRNAdb数据库成熟的tRNA和tRNA前体序列比对,获得在AMI前后心肌中差异表达的tsRNA谱.采用生物信息学分析同一密码子对应的tRNA在AMI前后剪切方式的改变.依据AMI前后tsRNA表达谱差异,获得在AMI后特异性高丰度表达的tsRNA,并在AMI小鼠心肌和血浆中验证,探讨tsRNA作为AMI诊断标志物的潜能.结果 tsRNA表达谱在组内有较好的重复性,组间差异较大.发生 AMI 后,Asn-GTT、Glu-TTC、Gly-ACC、Gly-GCC、His-GTG、Ile-AAT、Ile-GAT、Pro-TGG、Ser-AGA 和 Trp-CCA 在心肌中剪切方式发生改变,生成有明显差异的tsRNA表达谱.与Sham组相比,MI组有268个tsRNA表达上调,1 228个tsRNA 表达下调,且有64个特异性tsRNA.AMI建模第1天,小鼠 tRF-Gly-CCC-2-31、tiRNA-Val-CAC-1-32、tiRNA-Val-AAC-2-32、tiRNA-Glu-TTC-2-32 和 tiRNA-Lys-TTT-1-34 在心肌中特异性表达,其中 tiRNA-Val-AAC-2-32 和 tiRNA-Lys-TTT-1-34在AMI小鼠血浆中特异性高丰度表达,并随AMI持续时间动态变化.结论tsRNA表达谱在AMI前后差异显著,其中在小鼠心肌和血浆中特异性表达的tiRNA-Val-AAC-2-32和tiRNA-Lys-TTT-1-34有AMI诊断潜能,可能在AMI修复过程中发挥重要作用.

目的:产KPC-2型肺炎克雷伯菌可引起β-内酰胺类抗生素、碳青霉烯类抗生素产生耐药性.通过噬菌体展示技术从抗KPC-2纳米抗体文库中筛选与KPC-2特异性结合的纳米抗体,为产KPC-2型肺炎克雷伯菌耐药性的检测和诊断提供技术支持.方法:利用重组KPC-2免疫双峰骆驼,从骆驼的外周血淋巴细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,通过两轮嵌套式PCR扩增出纳米抗体片段,构建抗体文库,并通过噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体.通过HPLC和OCTET分别进行表位分析和亲和力测定.结果:构建了一个库容为5.47×108 cfu/ml且插入有效片段不低于81.25%的纳米抗体文库;并建立抗KPC-2纳米抗体的免疫淘选方法;获得了2个不同CDR3区的纳米抗体K2和K5,亲和力分别为6.0 nmol/L和4.8 nmol/L.且在KPC-2上具有2个非竞争性结合表位.结论:成功淘选出2个不同表位的特异性纳米抗体,有望替代传统抗体用于肺炎克雷伯菌耐药性疾病的检测和诊断.