目的 基于Ms2噬菌体制备内含仙台病毒(Sendai virus,SeV)RNA的假病毒装甲RNA标准质控品,以期应用于SeV感染的诊断及该病毒的分子生物学安全检测.方法 将SeV的L基因片段插入质粒pET-28b-Ms2中,构建重组质粒pET-28b-Ms2-L(SeV).将重组质粒转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白,即SeV假病毒装甲RNA标准质控品.将标准质控品置电镜下观察其形态,并进行10％SDS-PAGE分析、抗DNase Ⅰ及抗RNsaeA试验、稳定性分析.采用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术对SeV、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)、汉坦病毒(Hantaan virus,HV)、呼肠弧病毒 Ⅲ 型(reovirus type Ⅲ,ReoⅢ)、小鼠细小病毒(minute virus of mice,MVM)进行检测,验证标准质控品的效果.结果 标准质控品于电镜下呈Ms2噬菌体假病毒颗粒结构,相对分子质量约为14 000,可有效抵抗DNase Ⅰ及RNsaeA的降解.标准质控品于-80 ℃保存6个月、-20 ℃保存6个月、28 ℃保存5、10、15 d后仍具有良好的稳定性.仅SeV可见RPA特异性扩增曲线,其他病毒均未出现扩增曲线.结论 本研究构建的SeV假病毒装甲RNA标准质控品具有良好的稳定性及特异性,可作为SeV的各项分子生物学安全检测的阳性对照.

目的:制备一种可涂覆于材料表面、具有抑菌抗病毒性能的涂膜,旨在应用于多种公共场所设施表面以控制病原微生物的传播.方法:以无毒易挥发的乙醇溶解聚乙烯醇缩丁醛(PVB)树脂材料,通过掺杂具有抑菌抗病毒性能的纳米氧化锌(ZnONP)或纳米氧化铜(CuONP)颗粒,制备具有抑菌抗病毒性能的涂膜材料,并研究纳米颗粒种类、粒径、掺杂量对涂膜消毒性能的影响.结果:扫描电镜表征结果表明CuONP和 ZnONP 可与 PVB形成稳定涂膜,且该涂膜的接触面积越大、纳米颗粒掺杂量越高,对大肠杆菌、MS2 噬菌体的灭活效果越好.接触面积大于80 cm2 时灭活率可达 90%,且去除速率大于 1%/min.结论:PVB复合涂膜具有高效的抑菌抗病毒活性,可为公共卫生消毒提供新手段.

目的 建立淋巴细胞激活基因3(LAG-3)免疫噬菌体纳米抗体文库,获得高特异性和亲和力的抗LAG-3纳米抗体,并鉴定其功能活性.方法 采用人LAG-3蛋白免疫羊驼,获取外周血cDNA;通过巢式PCR获得纳米抗体基因,构建至pComb3XSS质粒,电转至大肠杆菌XL1-Blue中构建纳米抗体噬菌体免疫文库,并对文库进行质量分析.通过噬菌体展示技术筛选抗LAG-3特异性纳米抗体,通过第二代基因测序技术获得纳米抗体的基因序列.将目的序列构建到大肠杆菌BL21(DE3)周质表达载体pET-22b(+)中进行抗体表达,Prism A柱进行纯化,通过高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS)、ELISA、Western blot法和表面等离子共振技术(SPR)进行抗体性质和功能分析.结果 构建的纳米抗体噬菌体免疫文库的库容为7.20 ×108菌落形成单位(CFU),序列分析文库多样性良好,经过4轮淘筛后获得3条具有不同氨基酸序列的抗LAG-3纳米抗体,分别为重链抗体重链可变区结构域-L1-3(VHH-L1-3)、VHH-L3-2和VHH-L13-2,纳米抗体表达纯化后纯度在95％以上,三种抗体均可以与重组人LAG-3蛋白进行特异性结合;其中VHH-L13-2抗体的亲和力指数KD值为3.971 × 10 mol/L,且对于LAG-3和纤维蛋白原样蛋白1(FGL-1)的结合具有抑制作用,半数抑制浓度(IC50)值为15.58 nmol/L.结论 成功构建了 LAG-3纳米抗体噬菌体免疫文库,筛选获得了特异性好、亲和力高的LAG-3纳米抗体,且对于LAG-3与其配体的结合具有一定的抑制作用.

[背景]F-RNA噬菌体近年来常被作为水环境中诺如病毒污染的指示物.本课题组前期以大肠杆菌ATCC700891T为宿主,从人便样中筛选出一株F-RNA噬菌体YM1,其与大肠杆菌噬菌体MS2 亲缘关系最近,MS2 宿主通常为含有性菌毛的雄性大肠杆菌.[目的]探索F-RNA噬菌体与其肠道宿主及诺如病毒之间的互作关系,筛选 YM1 的肠道宿主.[方法]采用选择性培养基筛选YM1 阳性便样中的大肠杆菌并进行YM1 侵染验证,结合 16S rRNA基因扩增子测序分析YM1接种前后便样中的差异性菌群种类,对YM1 阳性便样中潜在的YM1 肠道宿主进行分析.[结果]筛选到 351 个大肠杆菌菌株,YM1 侵染结果表明这些大肠杆菌均不是YM1 的宿主;16S rRNA基因扩增子测序分析差异性菌种显示,Enterobacter sp.(OTU144)和Enterobacter sp.(OTU11)这 2 株肠杆菌属细菌的相对丰度在YM1 感染后发生显著性的降低,表明该 2 种细菌可能为YM1 的潜在肠道宿主.[结论]YM1 具有严格的宿主特异性,便样中大肠杆菌并非YM1 的肠道宿主,同时发现了 2种YM1 的潜在宿主,为进一步筛选分离YM1 的肠道宿主提供了方向和依据.

本研究建立了一种简单、精确和高效的新型抑制植物基因表达的技术体系.将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、指导RNA (guide RNA,gRNA)和编码转录抑制因子与噬菌体外壳融合蛋白的三种基因构建到植物表达载体中.利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术侵染本氏烟草.研究显示gfp基因在烟草叶片中的表达受到显著抑制,抑制率达到36.2％.此系统可运用于对其他基因进行基因调控,由于只需要改变gRNA,而其他组成原件保持不变,因此该技术具有操作简单及广泛的适应性等特点.为在植物基因组中精确抑制基因表达提供了有效的工具.

目的 比较MS2噬菌体和脊髓灰质炎病毒I型(Poliovirus-I,PV-I)对二溴海因消毒剂的抵抗力大小,筛选用于评价消毒因子灭活肠道病毒效果的指示病毒.方法 参考2002年版《消毒技术规范》,灭活病毒效果的评价采用病毒悬液定量灭活试验设计,分别对MS2噬菌体和PV-I进行病毒灭活试验.结果 二溴海因消毒剂的浓度250 mg/L、作用10 min和375 mg/L、作用5 min,对MS2噬菌体的灭活对数值分别达到4.04和6.11.二溴海因消毒剂的浓度500 mg/L、作用20 min和375 mg/L、作用50 min,对PV-I的灭活对数值分别达到4.42和4.27.相同浓度(375 mg/L)的二溴海因消毒剂灭活病毒MS2噬菌体和PV-I达到消毒水平(灭活对数值≥4.00)的浓时积值(C·t)分别为1875 mg·min/L和18750 mg·min/L.结论 病毒MS2噬菌体对二溴海因的抵抗力弱于PV-I.

目的 建立一种安全、简便和费用低廉的测试洗手及洗手产品除病毒效果的离体试验方法.方法 以噬菌体为替代病毒,仿真皮为载体设计试验流程,分析影响试验结果的要素,通过数据分析,研究洗手产品回收稀释液种类、噬菌体初始接种浓度及回收方式对结果稳定性的影响.使用不同洗手产品对多种噬菌体分别进行除病毒效果测试后进行统计分析,确定方法的适用性.结果 以噬菌体φX174为污染病毒,0.1％蛋白胨生理盐水做为香皂和洗手液的回收稀释液使用时,其噬菌体的回收值为5.57和5.54,明显高于改良李氏肉汤吐温培养基(MLBT)、多用中和剂(PVUN)及磷酸缓冲液(PBS);对手摇瓶子2min、摇床200 r/min振摇2min、均质器标准强度快速拍打2min后测得的噬菌体回收量进行单因素方差分析,P0.05=0.72,表明3者无统计学差异,但是在使用均质器拍打时的变异系数(CV)为0.74％最小,数据最稳定;4个初始接种浓度中,只有在107 pfu/mL与108 pfu/mL的浓度下,平皿上的噬菌体数量符合实验设计,超过4 Log10,对这2个浓度实验结果进行t检验,其P0.05=0.003,结合回收数据,认为108pfu/mL是最合适的加样浓度;使用上述参数,分别以噬菌体MS2、0X174、φ6为污染病毒,使用香皂、洗手液及清水进行洗手除病毒评价,所有结果CV均＜15％.结论 采用108 pfu/mL的噬菌体悬液污染仿真皮后使用洗手产品模拟洗手,均质器拍打2 min、0.1％蛋白胨生理盐水进行回收稀释,实验结果最稳定.多次重复实验结果显示,该方法适用于多种噬菌体,也适用于多种洗手产品,是一种简单可行的洗手及洗手产品除病毒效果评价方法,具有较高的应用价值.

目的 构建用于阿尼昂尼昂热核酸检测的病毒样颗粒质控品,并对其进行评价.方法 体外合成MS2噬菌体和阿尼昂尼昂病毒相关基因,通过酶切连接的方式构建表达载体,IPTG诱导表达并经Co柱纯化获得病毒样颗粒,同基质混合后制成质控品,采用荧光RT?PCR方法对质控品的均匀性、运输稳定性、保存稳定性和冻融稳定性进行系统评价.结果 成功构建pET?MS2?ONNV表达载体并获得了纯化的病毒样颗粒.制备的质控品无质粒DNA污染,均匀性测试时变异系数为1.25％,往返运输后Ct值变化不明显,可在4、-20、-70℃条件下保存至少30 d,并可经受8次反复冻融.结论 本研究获得了均一、稳定、耐冻融的阿尼昂尼昂热核酸检测病毒样颗粒质控品,对阿尼昂尼昂热的防控具有重要意义,也为其它类似传染病病原体的质控品构建和评价提供了一个可行的方法.

目的 建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法.方法 设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价.结果 本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系.引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒.将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测.结果 显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测.灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒.利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价.结果 表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好.结论 本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测.

目的:确定稳定且高效的电转化实验方案以达到构建高库容噬菌体展示抗体库的目的.方法:探索电压、脉冲时间、噬菌粒DNA质量与浓度、TG1大肠杆菌的生长周期、重悬洗涤缓冲液及培养基优化等方面对TG1大肠杆菌电转化效率的影响.结果:当电转杯电极间距为2mm时,设定电转仪参数为3kV、25μF、5ms、200Ω;外源DNA经纯化后加入感受态菌液中使终浓度为1ng/μl;培养基中加入20mmol/L的MgCl2,并将TG1的生长阶段调控在OD600=0.8,用无菌超纯水重悬及洗涤细胞,将感受态细胞浓度调整为4×1010个/ml.在上述条件下,电转化效率可达到4.9×109CFU/μg DNA.结论:通过多种条件优化,提高了电转化效率,为构建高库容噬菌体展示抗体库建立了基础.