目的:探讨咪达唑仑对被剥夺氧和葡萄糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)后的N2a/APP695细胞淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)代谢变化的影响及机制。方法:将处于对数生长期的N2a/APP695细胞用平衡盐缓冲液冲洗后随机分为空白组、对照组及实验组。空白组未经OGD处理，在正常培养箱内培养；对照组行OGD处理后继续培养复氧；实验组在OGD处理后加入不同浓度(分别为70、100、125、150 ng/ml)的咪达唑仑继续培养复氧。24 h后用AnnexinV-FITC/双染法流式细胞术检测各组细胞凋亡比例；用Western blot方法检测各组细胞的Caspase-3、Aβ 1-42、解整合素金属蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)、β-淀粉样前体蛋白水解酶1(β-site APP cleavage enzyme-1，BACE1)、早老素1(presenilin 1，PS1)蛋白水平。 结果:与空白组相比，对照组的细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ 1-42、BACE1及PS1水平显著升高( P<0.05)；APP及ADAM10水平无明显变化( P>0.05)。与对照组相比，实验组细胞凋亡比例、Caspase-3、Aβ 1-42显著下降( P<0.05)；咪达唑仑70 ng/ml组BACE1显著下降( P<0.05)，而APP、ADAM10及PS1无明显变化( P>0.05)。 结论:OGD可通过上调BACE1及PS-1导致Aβ 1-42表达增加促使细胞凋亡；而咪达唑仑可通过下调BACE1减少Aβ 1-42表达进而减少神经细胞凋亡，发挥对OGD损伤后N2a/APP695细胞的保护作用。

目的 探讨凋亡相关斑点样蛋白(ASC)不同表位抗体对β淀粉样蛋白(Aβ)聚集和神经毒性的作用.方法 SH-SY5Y-APP695细胞培养体系培育按实验目的分组:A组(25 μmol/L Aβ)、B组(2 μmol/L ASC)、C组(2 μmol/L ASC+25 μmol/L Aβ+10 μg/ml AL177)、D 组(2 μmol/L ASC+25 μmo/L Aβ+10 μg/ml ab155970)、E 组(25μmol/L Aβ+2 μmol/L ASC)用于探讨重组ASC蛋白与Aβ蛋白结合.对照组[磷酸盐吐温缓冲液(PBST)]、Aβ组(10 μmol/L Aβ)、Aβ+N 端组(10 μmol/L Aβ+10 μg/ml AL177)、Aβ+C 端组(10 μmo/L Aβ+10 μg/ml ab155970)用于探讨细胞炎性反应.Ⅰ 组(PBST)、Ⅱ 组(10 μmol/L Aβ)、Ⅲ 组(10 μmol/L Aβ+10 μg/ml AL177)、Ⅳ组(10 μmol/L Aβ+10 μg/ml ab155970)用于细胞毒性检测.N 端组[10 μg/ml AL177+10 μg/ml 异硫氰酸荧光素(FITC)-Aβ42]、C 端组(10 μg/ml ab155970+10 μg/ml FITC-Aβ42)、空白组(PBST)用于免疫荧光染色.结果 与A组比较,C组细胞中Aβ聚集减少,D组Aβ聚集增多(P＜0.01).与对照组比较,Aβ+C端组Aβ引起的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1含量明显增高,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).噻唑蓝法检测结果显示,Ⅱ组细胞活性低于Ⅰ组,差异有统计学意义(1.12±4.25 vs 0.73±5.68,P＜0.01);Ⅲ组细胞活性明显高于Ⅱ组,差异有统计学意义(1.28±2.21 vs 0.73±5.68,P＜0.05).结论 ASC蛋白N端抗体AL177抑制Aβ聚集,ASC蛋白C端抗体ab155970促进Aβ聚集,并具有时间依赖性.C端抗体刺激Aβ引起炎性反应,N端抗体拮抗对Aβ神经细胞毒性.表明ASC不同表位抗体对Aβ聚集及神经毒性具有不同作用,对阿尔茨海默病防治有一定的应用前景.

目的 研究50 Hz磁场暴露对Neuro2a/APP(695)细胞基因转录的影响.方法 Neuro2a/APP(695)细胞简单随机分为假性辐照组和磁场暴露组(n=3).暴露条件为1.0 mT 50 Hz正旋波磁场,4 h/d,连续3 d;假性辐照组细胞除无磁场暴露外,余同磁场暴露组.暴露结束后按标准方法送样,进行转录组测序检测,包括样品RNA提取、数据质量评价和数据分析等.结果 50 Hz磁场暴露后Neuro2a/APP(695)细胞有141种定性的基因表达发生了明显的变化,其中有129种表达上调、12种表达下调.GO富集分析结果显示,Neuro2a/APP(695)细胞中62种上调差异表达基因涉及432类显著GO功能富集,其中涉及生物学过程337类、细胞组分16类、分子功能79类;3种下调差异表达基因共涉及275类显著GO功能富集,其中涉及生物学过程260类、细胞组分5类、分子功能10类.KEGG通路分析显示,这些差异基因可能参与了 20条KEGG通路,其中2个下调差异表达基因通路,18个上调差异表达基因通路.结论 50 Hz磁场暴露可能对Neuro2a/APP(695)细胞的黏附连接、Hippo信号通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素、蛋白消化和吸收和甘露糖型O-聚糖生物合成等方面产生影响,以上通路可能是50 Hz磁场对Neuro2a/APP(695)细胞产生影响的主要途径.

目的:观察姜黄素(curcumin)对N2a/APP695swe细胞线粒体形态和功能及细胞凋亡的影响;探讨其可能的神经保护机制.方法:实验细胞分为4个组:N2a/APP695组(WT)、N2a/APP695swe组(APP)、溶剂对照组(DMSO,5 μmol/L)、姜黄素组(Curcumin,5μmol/L).流式细胞术分别检测细胞凋亡、活性氧水平和膜电位水平、免疫细胞化学检测细胞色素C的表达、电镜观察细胞线粒体形态的改变,Western blot检测Caspase3、Caspase9蛋白表达,分光光度检测Caspase3、Caspase9酶活性.结果:流式细胞术结果显示,Curcumin组细胞的凋亡率、活性氧水平较APP组明显降低[(0.05 ±0.01) vs.(0.18±0.01),P=0.000;(49.67±4.16) vs.(197.67 ±8.08),P=0.000];而Curcumin组线粒体膜电位较APP组升高[(1.00±0.03) vs.(0.64 ±0.03),P=0.000].电镜结果发现姜黄素可以减轻线粒体的肿胀,改善其形态.同时免疫细胞化学结果显示姜黄素减少了细胞色素C的释放.Western blot检测发现,与APP组相比,Curcumin组Caspase3、Caspase9蛋白的表达均降低[(0.62±0.12) vs.(1.39±0.10),P=0.000;(0.64±0.20) vs.(1.78±0.03),P=0.000];并且Curcumin组较APP组的Caspase3与Caspase9的活性明显降低[(0.66±0.04) vs.(2.12±0.06),P=0.000;(0.58±0.04) vs.(0.93±0.03),P=0.000].结论:姜黄素能抑制N2a/APP695swe细胞的凋亡,其机制可能与改善线粒体功能有关.

目的 探讨β1,2-N-乙酰氨基葡萄糖-氧位-甘露糖基转移酶1(protein O-linked mannose β1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1,POMGnT1)基因是否参与了阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的病理生理过程.方法 通过实时PCR和蛋白免疫印迹法,检测POMGnT1基因在AD模型细胞系[N2a/淀粉样前体蛋白(APP) 695 swe,n=3]和正常对照细胞系(N2a/wt,n=3)转录和翻译水平上的差异.利用免疫荧光染色比较POMGnT1基因在5个月龄AD模型小鼠(APP/PS1,n=3)和同月龄正常野生型对照小鼠脑组织(n=3)中的表达差异.通过免疫组织化学的方法,检测POMGnT1基因敲除小鼠2个月龄(n=3)和1岁龄(n=3)脑组织中β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积的差异.结果 POMGnT1基因在AD模型细胞系中mRNA(0.80±0.02)和蛋白质(0.50±0.02)的含量均显著低于正常对照细胞系(mRNA:1.00,t=10.52,P＜0.01;蛋白质:1.31±0.04,t=18.64,P＜0.01).免疫荧光染色结果显示,POMGnT1在AD模型小鼠中的阳性表达率明显低于正常野生型对照小鼠.免疫组织化学结果显示,2个月龄(0.358±0.014和0.048±0.001,t=22.58,P＜0.01)和1岁龄(0.266±0.004和0.229±0.003,t=7.771,P=0.002) POMGnT 1-/-小鼠的脑中Aβ沉积均显著较同月龄正常野生型小鼠多.结论 POMGnT1基因参与了AD的病理生理过程,并且起到了正向保护作用.

目的:研究姜黄素(curcumin)对N2a/APP695swe细胞中自噬和Rab家族蛋白的影响,并且探讨姜黄素调节N2a/APP695swe细胞自噬的可能机制.方法:采用N2a/WT和N2a/APP695swe细胞,并将其分为4个组:N2a/WT组(WT组)、N2a/APP695swe组(APP组)、DMSO溶剂对照组(DMSO组,5μmol/L,24 h)、curcumin处理组(curcumin组,5μmol/L,24 h).Western blot分别检测各组自噬标志性蛋白LC3BⅡ和底物蛋白SQSTM1的表达,以及Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7、Rab9、Rab24和Rab33B的表达;共聚焦显微镜观察免疫荧光进一步验证各组LC3BⅡ与SQSTM1蛋白的表达情况.结果:Western blot结果表示,curcumin组LC3BⅡ蛋白表达量明显高于APP组和DMSO组(0.54±0.02 vs.0.29±0.09,0.54±0.02 vs.0.29±0.09,P=0.000);同时,curcumin组SQSTM1蛋白表达量则明显低于APP组(0.67±0.01 vs.1.02±0.02,P=0.000).共聚焦显微镜观察免疫荧光实验再次验证了LC3B和SQSTM1蛋白的这种表达趋势.Western blot进一步检测发现,与APP组相比,curcumin组Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的蛋白表达量均明显增加(1.00±0.02 vs.0.63±0.02,P=0.000;0.94±0.03 vs.0.79±0.03,P=0.000;0.75±0.00vs.0.56±0.01,P=0.000;0.88±0.04 vs.0.59±0.03,P=0.000),而Rab9和Rab24的改变差异无统计学意义(1.04±0.02 vs.1.06±0.02,P=0.578;0.79±0.00 vs.0.80±0.00,P=0.067).结论:姜黄素提高N2a/APP695swe细胞的自噬水平,其机制可能与增强Rab家族蛋白Rab1、Rab5、Rab7和Rab33B的表达有关.

目的 mTOR信号通路在Aβ诱导的神经退行性病变中起重要作用,mTOR抑制剂雷帕霉素具有潜在治疗作用.研究含噻唑侧链的雷帕霉素新衍生物FIM-X7对N2a-APP695细胞表达Aβ的影响,探讨FIM-X7在阿尔茨海默症的应用前景.方法 ELISA方法检测FIM-X7对N2a-APP695细胞表达Aβ40和Aβ42的影响,Western-blot检测FIM-X7对N2a-APP695细胞表达自噬相关蛋白和mTOR信号通路的影响,淋巴细胞转化实验测定FIM-X7的免疫抑制活性,MTT法检测FIM-X7对N2a-APP695细胞增殖的影响,流式细胞术分析FIM-X7对N2a-APP695细胞凋亡的作用.结果 FIM-X7通过抑制mTOR信号通路、降低自噬相关蛋白ULK1的磷酸化,促进细胞自噬进而降低N2a-APP695表达Aβ的水平;其对N2a-APP695细胞内Aβ40和Aβ42的作用效果与雷帕霉素相当.此外,FIM-X7几乎没有细胞毒性,对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化的抑制活性仅为雷帕霉素的1/5000.结论 雷帕霉素新衍生物FIM-X7具有降低N2a-APP695细胞表达Aβ40和Aβ42的作用,且具有比雷帕霉素更低的细胞毒性和免疫抑制活性,因此可能在阿尔茨海默症的治疗上具有进一步研究的价值.

目的:探究天青B对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)代谢及β淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)生成的影响.方法:用天青B处理能稳定表达APP695基因的Neuron-2a细胞(N2a-APP695).利用Western blot检测APP、可溶性APPα(soluble APPα,sAPPα)和β-分泌酶 1(β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1)的水平,利用 ELISA 检测 Aβ 的水平.采用 BACE1酶活性检测试剂盒检测BACE1酶活性的抑制.采用t检验分析各组数据.结果:①天青B在5、10、15、20 μmol/L的终浓度下不会影响N2a-APP695细胞的活力.②ELISA检测结果显示天青B能够降低Aβ1-40(P=0.002)和Aβ1-42(P=0.036)的水平.③Western blot检测结果显示天青B能够降低全长APP(P=0.018)和sAPPα(P=0.006)蛋白的水平,但不影响BACE1蛋白的水平(P＞0.05).④BACE1酶活性检测试剂盒检测结果显示天青B能降低BACE1的活性,其活性抑制率为66.0％(P=0.000).结论:天青B通过抑制APP的表达和BACE1的活性从而抑制Aβ的生成.

目的:观察姜黄素(curcumin)对稳定表达APP695swe的Neuro-2a小鼠脑神经瘤细胞(N2a/APP695swe)中自噬流的作用;再进一步深入探讨其作用于N2a/APP695swe细胞中自噬流的可能机制.方法:首先将细胞分成4组:野生型对照组(WT组)、空白对照组(Control组)、溶剂对照组(Sham组)、姜黄素组(Curcumin组).透射电镜观察各组中自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ的表达;并分别运用Western blot及免疫荧光检测Rab7蛋白表达,实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测Rab7 mRNA表达.在N2a/APP695swe细胞中分别过表达及沉默Rab7后,将细胞分成5组:Control组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-Rab7组、NC-siRNA组和Rab7-siRNA组.再运用透射电镜观察各组自噬体形态特点,Western blot检测p62和LC3Ⅱ蛋白表达.结果:经姜黄素处理后,透射电镜观察到细胞中的自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,同时,自噬活性关键性蛋白LC3Ⅱ的表达增加(P=-0.000),而自噬底物蛋白p62的表达减少(P=0.000);Rab7在蛋白水平及mRNA水平均明显升高(P=0.000、0.000).过表达Rab7后,自噬体主要为单层膜结构的自噬溶酶体,p62蛋白表达明显减少(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.669).沉默Rab7后,自噬体主要为双层膜结构的早期自噬体形态,p62蛋白表达明显增加(P=0.000),LC3Ⅱ蛋白表达无明显变化(P=0.622).结论:姜黄素促进N2a/APP695swe细胞中的自噬流,其作用机制可能与增强Rab7表达有关.

目的 探讨FoxO3a介导药根碱(JAT)保护稳转APP695swedish基因的小鼠神经瘤N2a细胞(N2a-SW)模型中损伤线粒体的机制.方法 以小鼠神经瘤N2a细胞为对照组,N2a-SW细胞为AD模型组,应用不同浓度JAT进行处理后,检测JAT对模型组损伤线粒体中FoxO3a、mRNA及线粒体相关蛋白的表达影响.结果 与N2a组相比较,SW模型组细胞形态呈明显损伤形态、细胞中Aβ蛋白表达增加至(176.01±17.47)％、细胞内活性氧ROS聚集升高至(264.14±8.93)％;与SW组相比,应用20 μmol/L、40 μmol/L JAT处理SW细胞24 h后,可以降低ROS水平分别至(170.06±8.20)％、(100.51±11.81)％;与 SW 组相比,不同浓度 JAT(10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)处理组不仅可以减少细胞色素C(Cyto-c)在胞浆中的释放[分别为(66.71±7.88)％、(67.99±6.89)％、(56.64±5.99)％],降低线粒体分裂调节蛋白Drp1的表达[分别为(67.62±5.87)％、(56.99±3.62)％、(38.00±10.16)％],还可抑制SW组FoxO3a磷酸化蛋白表达[分别为(66.49±3.11)％、(42.14±1.94)％、(51.12±4.55)％],并增加线粒体核心蛋白PGC1α的表达[分别为(201.51±12.43)％、(179.43±1.77)％、(157.80±16.32)％]及mRNA的表达[分别为(162.46±5.98)％、(244.92±2.67)％、(149.11±4.76)％],而总蛋白FoxO3a及mRNA不受影响,上述结果差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 JAT可能通过FoxO3a来发挥对阿尔茨海默病损伤线粒体的保护作用.