目的 通过噬菌体展示技术,从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体,纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库,并进行免疫淘选.方法 将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后,构建质粒RSPO1-pCMV-Fc,瞬时转染 HEK-293F 细胞,表达 RSPO1 蛋白;经 Protein A 凝胶柱、HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200pg 柱、Super-dexTM 24 Increase10/300GL柱依次纯化RSPO 1蛋白后,免疫骆驼,收集外周血并分离淋巴细胞;提取细胞RNA,反转录合成cDNA,通过2步巢式PCR扩增VHH片段,克隆至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示文库,经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后,进行ELISA鉴定并测序.结果 质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确.表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172 000,纯度约为70％;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2× 108cfu,经2轮淘选使噬菌体富集度达到12;共获得19个纳米抗体序列.结论 获得了多样性良好的纳米抗体序列,为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能.

纳米抗体(nanobody，Nb)是克隆重链抗体可变区得到的最小功能性抗原结合片段。Nb相较于经典抗体具有亲和力强、稳定性好、特异性强和免疫原性低等众多优点，在多种难治性疾病，特别是人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的诊治方面吸引了越来来越多的关注。近20年来，关于Nb在HIV感染相关领域的研究呈指数级增长，这些研究为人类感染HIV的检测、预防和治疗方法带来了全方位的更新，同时，对Nb创新性的改造也为Nb在HIV相关临床应用带来了新的思路。

目的:在哺乳动物细胞内基于线性双链DNA"与门"基因线路构建纳米抗体文库。方法:应用基于线性双链DNA的"与门"逻辑基因线路构建纳米抗体文库，首先通过PCR扩增将互补决定区（CDR）随机序列引入上、下游线性双链DNA，将其共转染至HEK293T细胞，转染48 h后，经RNA提取、cDNA合成、PCR扩增、高通量测序和数据处理步骤，鉴定"与门"形成的纳米抗体文库序列，对本策略进行了分析与评价。结果:深度测序共测得4 173 356条序列，其中约88.18%的序列为纳米抗体文库序列。文库核酸序列最丰富的序列长度为264 bp，为理论设计长度。后续在264 bp序列中鉴定出22 172种纳米抗体序列，且CDR1~3序列中的核苷酸频率符合NNK模式。结论:本研究开发了一种基于线性双链DNA"与门"逻辑基因线路在哺乳动物细胞中构建纳米抗体文库的新方法。

目的:制备融合C3Fab的抗程序性死亡-配体1（PD-L1）纳米抗体P3C8-C3Fab，并研究其对血浆半衰期的影响。方法:将来源于蛋白G的C3Fab肽段，通过DNA重组技术与纳米抗体P3C8进行分子融合，并构建重组质粒pET21a-P3C8-C3Fab，在大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达和纯化，并采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测P3C8-C3Fab与PD-L1蛋白、小鼠IgG和表达PD-L1肿瘤细胞的结合，利用双抗夹心ELISA检测不同时间小鼠血清中残留P3C8-C3Fab，以评估C3Fab对PD-L1纳米抗体血浆半衰期的延长作用。结果:成功构建了融合C3Fab的抗PD-L1纳米抗体P3C8-C3Fab，其在BL21菌中以可溶形式高效表达，经纯化获得质量分数约为90%的NbP3C8-C3Fab蛋白，得率为7.18 mg/L。P3C8-C3Fab随着质量浓度的增加，对PD-L1蛋白和小鼠IgG亲和力也逐渐升高，且呈现浓度相关性；P3C8-C3Fab与肺癌A549细胞的结合呈浓度相关性。小鼠血清中P3C8-C3Fab的浓度标准曲线呈典型的S型浓度相关性；P3C8血浆半衰期仅为0.44 h，而P3C8-C3Fab的血浆半衰期达到9.36 h，血浆半衰期延长了21.27倍。结论:C3Fab与纳米抗体P3C8连接可以显著延长其血浆半衰期，对改善纳米抗体的体内作用具有应用价值。

胰腺多肽(pancreatic polypeptide,PP)是一种含36个氨基酸的胰腺激素,在评估胰腺功能和辅助诊断相关疾病中发挥重要作用.以PP为靶点,筛选特异性的PP纳米抗体,评估其与PP抗原是否具有结合活性.利用原核表达系统制备了高纯度的PP抗原,经免疫羊驼后构建了高库容和高丰度的胰腺多肽免疫的纳米抗体噬菌体文库,并通过噬菌体展示技术进行文库筛选,获得8株胰腺多肽纳米抗体.选取1株纳米抗体(PP-VHH)构建原核表达体系,经IPTG诱导表达、纯化与鉴定,通过间接ELISA和双抗夹心ELISA分别检测和评价抗原抗体的结合活性和血清中PP含量,结果显示,PP-VHH与PP具有结合活性,且PP-VHH可用于检测鸡和人血清中的PP.建立的双抗夹心ELISA法拟合曲线R2为0.9868,可检测不同个体鸡血清中PP浓度为48-55 pg/mL.而人血清中PP浓度范围波动较大.综上所述,本研究筛选到的1株纳米抗体PP-VHH,可用于检测鸡和人血清中的PP含量,为评估胰腺功能异常或诊断相关疾病提供基础.

目的:制备抗白细胞介素1β（IL-1β）纳米抗体，并观察其对缺氧小鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:利用DNA重组技术，使用pET-16b和pHEN1表达载体构建抗IL-1β纳米抗体的重组质粒（pET-16b-4G6M-VHH、pET-16b-5BVP-VHH、pET-16b-5MVZ-VHH和pHEN1-4G6M-VHH、pHEN1-5BVP-VHH、pHEN1-5MVZ-VHH，其中VHH为重链单域抗体，4G6M-VHH、5BVP-VHH、5MVZ-VHH分别为3种抗IL-1β的纳米抗体），将构建成功的质粒分别转入大肠杆菌Rosetta2（DE3）表达菌中进行诱导表达及镍柱纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western印迹对表达产物及纯化产物进行鉴定，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其亲和力。将纯化所得亲和力最高的抗IL-1β纳米抗体（pHEN1-5MVZ-VHH）应用于小鼠HL-1心肌细胞缺氧模型（分为正常对照组、缺氧模型组、空白质粒组及12.5、25.0、50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组），并检测细胞存活率及凋亡率。结果:SDS-PAGE和Western印迹结果显示，成功得到相对分子质量约15 000的抗IL-1β纳米抗体；ELISA结果显示，与pET-16b载体组相比，pHEN1载体组所表达的纳米抗体与IL-1β抗原的亲和力更高（4G6M-VHH组：3.20±0.03比1.20±0.03， P<0.001；5BVP-VHH组：3.18±0.06比1.21±0.02， P<0.001；5MVZ-VHH组：3.38±0.05比1.62±0.04， P<0.001）；细胞存活及凋亡检测结果显示，与缺氧模型组相比，25.0 μg/ml及50.0 μg/ml pHEN1-5MVZ-VHH处理组HL-1细胞活性增加［（75.55±2.23）%比（46.90±2.51）%， P<0.001；（74.36±1.96）%比（46.90±2.51）%， P<0.001］，凋亡率降低［（6.83±0.27）%比（10.24±0.76）%， P<0.001；（6.68±0.38）%比（10.24±0.76）%， P<0.001］。 结论:pET-16b和pHEN1载体均能表达出抗IL-1β纳米抗体，且pHEN1载体表达的纳米抗体具有更好的抗原亲和作用。此外，pHEN1-5MVZ-VHH治疗可减少缺氧小鼠心肌细胞凋亡。

目的:基于二氧四氢喋啶合酶（LS）多聚纳米抗体，建立一种检测血清中可溶性细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）蛋白的方法。方法:采用竞争ELISA筛选识别PD-L1不同表位的纳米抗体作为配对抗体，建立双纳米抗体夹心ELISA检测方法（Nbs-ELISA）。为了进一步提高敏感性，将纳米抗体与LS进行融合，获得多聚形式的纳米抗体作为sPD-L1蛋白的捕获分子，建立基于LS的多聚纳米抗体ELISA检测方法（LSNbs-ELISA）。结果:与Nbs-ELISA方法相比，LSNbs-ELISA方法对sPD-L1的检测敏感性提高了约11倍，Nbs-ELISA对血清中sPD-L1的检出限为2.87 ng/ml，而LSNbs-ELISA对PD-L1的检出限为0.255 ng/ml。2种检测方法对sPD-L1的检测均具有很高的特异性，与掺入血液中的PD-1、CD27、CD70、CD137和CD147蛋白均不结合。结论:建立的基于LS多聚纳米抗体检测血清中PD-L1的检测方法有较高的敏感性和特异性，对肺癌患者血清中可溶性PD-L1的检测具有潜在的临床应用价值。

纳米抗体凭借其优越的靶向性、稳定性、溶解度及组织穿透能力，已成为分子影像领域中的热门靶向分子。多种基于纳米抗体的分子影像探针在临床前研究和临床试验中均已展现出良好的诊断效能。笔者主要介绍纳米抗体分子影像探针在肿瘤中的最新研究进展，并进一步讨论其临床转化面临的挑战和应对策略。

目的:评价前期获得的1株仅具有互补决定区3（CDR3）的单域抗体（sdAbs）NBL42作为纳米抗体亲和力移植通用框架的潜力。方法:采用亲和力转移的方法将分别结合蒜氨酸酶、程序性死亡受体-1（PD-1）、溶菌酶和CD47的4种抗体VHH-A4、VHH-H5、cAb-Lys3和B6H12的CDR3序列移植到NBL42对应的CDR3区。DNA合成获得4种仅具有CDR3的重组sdAbs，镍柱纯化并获得目的蛋白，间接ELISA法检测4种重组纳米抗体与抗原的结合及其热稳定性。用Swiss Model三维建模分析移植前后sdAbs的空间结构。结果:纯化后的4种重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中呈现单一条带，相对分子质量与预期相符。移植后的重组sdAbs NBL42-A4CDR3和NBL42-H5CDR3获得了与蒜氨酸酶和PD-1的特异结合能力，但结合活性降低了约50%，并转变为可溶性表达形式。移植后的重组sdAbs NBL42-L3CDR3和NBL42-B6H12CDR3完全丧失了对原抗原溶菌酶和CD47的结合能力。在热稳定性分析中，移植后的重组sdAbs NBL42-A4CDR3和NBL42-H5/CDR3保留了约50%的剩余结合活性。根据C88Y突变实验和Swiss Model三维建模分析，提示NBL42-FR3中88位半胱氨酸对于亲和力转移可能具有重要作用。结论:NBL42具有作为CDR3移植和亲和力转移框架的潜力。

目的:探究H9人胚胎干细胞(H9-hESCs)细胞外囊泡(EVs)对子宫内膜损伤修复的影响.方法:从H9-hESCs培养上清中提取EVs并鉴定.建立小鼠子宫内膜损伤模型,将其双侧子宫分为EVs实验组和PBS对照组,分别进行EVs和PBS注射,HE染色观察子宫内膜组织病理学变化、免疫组化法分析增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况.通过EdU法、Western blot法评估EVs对人子宫内膜基质细胞(hEndoSCs)增殖的影响.结果:H9-hESCs-EVs是粒径为(144.7±2.1)nm并且具有膜结构的纳米小体,表达CD63和TSG101特征蛋白.与PBS组相比,EVs实验组子宫内膜组织形态完整、厚度及腺体数量增加,EVs实验组PCNA表达的平均光密度较PBS组显著升高(P<0.05).EdU、Western blot检测结果显示H9-hESCs-EVs促进hEndoSCs增殖,且与EVs呈现蛋白浓度正相关(P<0.05).结论:H9-hESCs-EVs通过提高子宫内膜基质细胞增殖促进子宫内膜损伤修复.