目的:基于所建立的患者源性口腔鳞状细胞癌类器官模型进行药物敏感性实验,对相应患者制定个性化药物治疗方案,观察其疗效与实验结果的匹配性.方法:本研究将通过活检或根治手术获得新鲜口腔鳞状细胞癌标本建立患者源性类器官模型,依托此模型对6种治疗口腔鳞状细胞癌药物(顺铂、紫杉醇、5-FU、西妥昔单抗、阿培利司、Nutlin-3)的敏感性进行测定,并对其中4例活检患者参考实验结果制定个性化用药方案,观察两个疗程后的近期治疗效果.结果:本研究成功建立了 10例OSCC类器官(成功率10/12,83.3％),均可稳定传代、扩增达4代以上,且与亲本肿瘤组织表现出高度一致的组织病理学特征.口腔鳞状细胞癌类器官模型在药敏实验结果中表现出个体化差异,4例接受药物治疗的患者肿瘤控制结果均达到部分缓解标准,与实验结果一致.结论:本实验建立的患者源性口腔鳞状细胞癌类器官模型高度还原了同源亲本肿瘤的组织病理学特点,基于该模型的体外药敏实验与相应患者临床治疗反应一致,为建立个性化口腔鳞状细胞癌精准药物治疗新体系奠定基础.

目的:构建小鼠成纤维细胞的衰老模型.方法:利用小鼠3T3成纤维细胞系,给予P53激动剂Nutlin3a(5 μ mol/L)诱导衰老成纤维细胞.使用β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase staining,SA-β-gal)衰老染色评估衰老细胞比例,使用实时定量聚合酶链反应(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR)的方法检测细胞中衰老标志分子 P16 和 Gls的mRNA表达变化.利用GLS1抑制剂BPTES处理衰老成纤维细胞评估对衰老细胞的清除作用,并评估了不同浓度的BPTES对衰老成纤维细胞的影响.结果:Nutlin3a可诱导3T3成纤维细胞衰老,与对照组细胞相比,成纤维细胞中SA-β-gal阳性的衰老细胞比例增加(11.8％vs.92.8％,P＜0.01).qRT-PCR结果显示诱导衰老的成纤维细胞中衰老标志分子P16和Gls的表达显著上调(P均＜0.01).BPTES处理也可显著减少Nutlin3a诱导的衰老成纤维细胞的数量(P＜0.01),并且BPTES对衰老细胞的杀伤作用呈剂量依赖性(P＜0.01).结论:使用P53激动剂Nutlin3a可成功建立成纤维细胞的细胞衰老模型,BPTES可有效清除衰老成纤维细胞.

目的 探讨二氧化钛纳米管形貌对衰老牙周膜干细胞分化能力的影响.方法 利用阳极氧化法,分别于20、70 V电压下制备出2种具有二氧化钛纳米管形貌的钛片(20V-NT、70V-NT),观察其表面形貌特征.在成骨诱导条件下培养年轻牙周膜干细胞,挑选具有促进成骨分化作用的表面形貌.用RO3306和Nutlin-3a诱导年轻牙周膜干细胞衰老,获得衰老的牙周膜干细胞.诱导衰老牙周膜干细胞成骨分化,观察表面形貌对衰老牙周膜干细胞成骨分化的影响.结果 阳极氧化法可在钛片表面形成纳米管形貌,且纳米管直径随电压的增大而增大;不同直径纳米管形貌对年轻牙周膜干细胞成骨分化的影响存在较大差异,20V-NT表面纳米形貌促成骨分化效果更明显.与光滑钛片相比,20V-NT表面纳米形貌提高了衰老牙周膜干细胞碱性磷酸酶阳性数量,促进了钙沉积以及成骨标志性基因Runt相关转录因子2、骨桥蛋白、骨钙素的表达.结论 特定的表面纳米形貌能增强衰老牙周膜干细胞的分化能力,为牙周再生和进一步提高种植体的性能提供了一种有效方法.

目的 探讨小鼠双微体同源基因 2(MDM2)抑制剂 Nutlin-3a对小鼠脂肪脂代谢功能的影响.方法 建立C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导肥胖(DIO)模型,随机分为对照组:腹腔注射DMSO,实验组:腹腔注射顺式咪唑啉类似物 3a(Nutlin-3a).实验期间进行葡萄糖耐量(GTT)以及胰岛素耐量(ITT)实验.实验结束后,分离小鼠附睾脂肪组织(eWAT)、皮下脂肪组织(iWAT)与棕色脂肪组织(BAT),对白色脂肪组织进行苏木精-伊红(HE)染色,观察脂肪细胞形态变化;RT-qPCR和Western blot检测eWAT中脂代谢相关基因表达.结果 与对照组相比,给予小鼠Nutlin-3a处理,增加DIO小鼠的体质量(P＜0.001);对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性没有影响;脂肪细胞体积减小;下调白色脂肪中脂滴结合蛋白诱导细胞凋亡DFF45 样效应因子C(CIDEC)的表达.结论 Nutlin-3a通过下调白色脂肪组织中CIDEC的表达抑制脂滴的形成.

目的:探究田蓟苷(tilianin,Til)预处理对缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2心肌细胞的保护作用.方法:体外培养H9c2心肌细胞,将其分为正常(Normal)组、模型(H/R)组、田蓟苷(Til)组、p53激动剂(Nutlin-3a)组、田蓟苷+p53激动剂(Til+Nutlin-3a)组,缺氧12 h再复氧6 h,建立H/R模型.CCK-8法测H9c2细胞活力,化学荧光法测ROS水平,试剂盒测LDH、MDA、SOD水平,JC-1法测线粒体膜电位(△Ψm),Annexin-FITC/PI和Fluo-3 AM分别结合流式细胞仪检测细胞凋亡率和Ca2+荧光强度,RT-PCR 测定 p53、NOX4、Bax、Bcl-2 mRNA 表达,免疫蛋白印迹法检测 p53、NOX4、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1 蛋白表达,免疫荧光法测定p53、NOX4蛋白表达.结果:相较于H/R组,Til组H9c2细胞活力增强(P＜0.01),ROS、LDH、MDA水平下降(P＜0.01),SOD水平上升(P＜0.01),△Ψm 增强(P＜0.01),早期和晚期凋亡细胞降低(P＜0.01),Ca2+荧光强度减弱(P＜0.01),p53、NOX4、Bax的mRNA和蛋白表达下降(P＜0.05,P＜0.01),Bcl-2的mRNA和蛋白表达上升(P＜0.01),Nrf2、HO-1的蛋白表达进一步上升(P＜0.01),p53、NOX4阳性细胞表达减少;单独应用Nutlin-3a后上述效应被削弱,而当加入Til后又不同程度逆转Nutlin-3a的效应.结论:Til对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞损伤具有显著的保护作用,该作用可能是通过调控p53/NOX4通路,抑制氧化应激和凋亡实现的.

目的:研究Nutlin-3(N-3)与紫杉醇(Taxol,TAX)在抑制乳腺癌MCF-7细胞株增殖及促凋亡中的作用及分子机制.方法:使用N-3及TAX处理乳腺癌MCF-7细胞,研究二者对细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期的影响,使用cyclin D1过表达的MCF-7细胞系(TRE3G-cyclin Dl-MCF-7)研究N-3在TAX诱导的细胞凋亡及细胞增殖抑制中的作用及可能的机制.结果:N-3和TAX均能够上调乳腺癌MCF-7细胞中p53蛋白的表达,同时抑制cyclin D1蛋白的表达,从而有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,促进细胞凋亡,导致细胞周期发生Go/G1期阻滞,S期比例下降.N-3与TAX的联用可增敏TAX的抗肿瘤效果;在TRE3G-cyclin Dl-MCF-7细胞中,过表达的cyclin D1可以抑制TAX对p53的上调,从而拮抗TAX对乳腺癌MCF-7细胞的促凋亡效应及增殖抑制效应,而N-3的应用可以重新上调p53的表达,有效逆转因过表达cyclin D1而导致的TAX对乳腺癌MCF-7细胞促凋亡效应及增殖抑制效应的拮抗作用,使得TRE3G-cyclin D1-MCF-7细胞再次对TAX治疗敏感.结论:N-3及TAX可能通过调节p53及cyclin D1的表达发挥抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导其凋亡的效应.

目的 明确烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)对成年小鼠心肌细胞在高糖条件下线粒体自噬及线粒体合成的影响及潜在机制.方法 分离成年小鼠心肌细胞后,将细胞分为:①对照组;②高糖组;③高糖+ NR组:④高糖+ NR+ Sirt3siRNA;⑤高糖+NR+过氧化物酶体增生物活化受体γ共激活剂(Peroxisome proliferator-activated receptorγco-activator,PGC)-1α siRNA组;⑥高糖+NR+ nutlin-3组.采用TUNEL法,流式细胞术检测凋亡指数(AI),JC-1染色检测线粒体膜电位,Western blot法检测自噬相关蛋白Atg5、LC3,p62等蛋白表达水平,线粒体自噬相关蛋白Parkin,线粒体合成相关蛋白PGC-1α,Tfam蛋白表达水平,Sift3.结果 与对照组相比,高糖干预后细胞AI增加(P＜0.01),线粒体膜电位降低(P＜0.01),PGC-1α、Tfam、Sift3、Atg5、LC3和Parkin表达降低(P＜0.01)、p62表达升高(P＜0.01).加入NR后,细胞凋亡减少(P＜0.01),线粒体膜电位增高(P＜0.01),PGC-1α、Tfam、Sirt3、Atg5、LC3和Parkin表达增高(P＜0.01)、p62表达降低(P＜0.01),然而,加入Sirt3siRNA,NR的作用减弱(P＜0.01);加入PGC-1 αsiRNA,NR作用减弱(P＜0.01),加入nutlin-3后,NR作用减弱(P＜0.01).结论 NR通过加入p53激动剂nutlin-3,改善线粒体自噬,NR通过提高PGC-1α表达水平改善线粒体合成,最终减轻高糖对成年小鼠心肌细胞的损伤.

目的 探讨Nutlin3和JQ1在骨肉瘤细胞中是否具有协同的抗骨肉瘤作用.方法 采用1.0μmol/L Nutlin3单药,0.5μmol/L JQ1单药以及两药联合处理骨肉瘤细胞,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞活性检测、协同效应分析、流式细胞仪检测凋亡和Western blot实验,检测Nutlin3 和JQ1两种药物的协同抗骨肉瘤效应,并探讨其分子机制.结果 CCK-8结果显示,在SJSA-1细胞株中,Nutlin3和JQ1单药均能够一定程度的抑制骨肉瘤细胞活性,半数抑制浓度(IC50)值分别为3.7 μmol/L和1.0 μmol/L;但两药联合处理后抗癌效果显著提高,IC50值减低至0.12 μmol/L;采用联合作用指数研究表明在携带有野生型p53的SJSA-1骨肉瘤细胞中CI值为0.18,在p53缺失的Saos-2骨肉瘤细胞中CI值为0.94,表明两个抗癌制剂具有高度协同作用,且这两种新型抗癌制剂的协同作用依赖于p53的活性.流式细胞仪检测凋亡发现1μmol/L Nutlin3和0.5μmol/L JQ1单药分别诱导15％和37％的细胞发生凋亡,两者联合能够诱导80％的细胞发生凋亡,显著高于单药的凋亡作用(P=0.000),表明两者联合能够诱导大量骨肉瘤细胞发生凋亡.Western blot结果显示Nutlin3和JQ1联合应用能够激发半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3高度活化,导致PARP绝大部分裂解,促进了凋亡信号的活化;同时也发现,Nutlin3和JQ1联合应用能够促进p53的表达升高.结论 新型抗癌制剂Nutlin3和JQ1具有明显的协同抗骨肉瘤作用,这种协同作用具有p53依赖性.

目的 多数急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的TP53表型为野生型,但p53功能常常被过表达的MDM2所抑制.本研究探讨p53-MDM2结合小分子拮抗剂Nutlin3对p53野生型急性髓系白血病细胞株OCI-AML3和MOLM13的杀伤作用及其机制.方法 CCK8法检测不同浓度Nutlin3对OCI-AML3及MOLM13细胞的增殖抑制作用,Annexin Ⅴ/PI及JC-1法检测不同浓度Nutlin3诱导OCI AML3和MOLM13细胞的凋亡情况,蛋白印迹法检测Nutlin3处理后线粒体凋亡通路相关蛋白PUMA、NOXA和PARP的表达变化.结果 CCK-8细胞毒性实验结果显示,0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的Nutlin3处理OCI-AML3细胞48 h抑制率分别为(19.26±0.09)％、(34.49±0.07)％、(21.54±0.14)％、(33.05±0.13)％和(72.48±0.07)％,上述浓度Nutlin3作用MOLM13细胞48 h的抑制率分别为(12.48±0.05)％、(26.71±0.01)％、(62.44±0.07)％、(84.28±0.06)％和(94.13±0.02)％,Nutlin3对OCI-AML3和MOLM13细胞具有明显的增殖抑制作用,呈剂量依赖性;Kruskal-Wallis检验分析表明,与对照组相比,1.25～10 μmol/L的Nutlin3处理OCI-AML3细胞与MOLM13细胞IC50分别为(5.53±2.86)和(2.03±0.23) μmol/L,差异均有统计学意义,x2值分别为6.485和79.68,P值分别为0.004和＜0.001.凋亡实验显示,Nutlin3能增加OCI-AML3及MOLM13细胞凋亡率,0.625、1.25、2.5、5、10 μmol/L的Nutlin3作用OCI-AML3细胞48 h凋亡率分别为(1.79±1.86)％、(1.29±1.74)％、(4.19±2.45)％、(10.21±3.65)％和(30.03±5.26)％,与对照组比较差异有统计学意义,x2=15.38,P=0.009;上述浓度Nutlin3作用MOLM13细胞48 h凋亡率分别为(2.33±0.13)％、(7.14±2.95)％、(30.79±7.25)％、(47.68±1.70)％和(59.64±8.75)％,与对照组比较差异有统计学意义,x2=58.37,P＜0.001. JC-1法检测线粒体膜电位变化结果显示,Nutlin3能显著降低线粒体膜电位,2、4、8μmol/L的Nutlin3 JC-1多聚体/单体比值分别为0.44±0.01、0.41±0.01和0.23±0.02,与对照组(0.55±0.02)比较差异有统计学意义,P＜0.001.蛋白印迹结果显示,Nutlin3能促进p53及其下游的促凋亡蛋白PUMA和NOXA的表达,活化Caspase-3;Z-VAD-FMK能部分挽救Nutlin3所导致的凋亡.说明Nutlin3介导的OCI-AML3细胞死亡部分通过Caspase依赖的凋亡而实现.结论 Nut-lin3可能通过活化p53诱导线粒体凋亡通路从而诱导p53野生型AML细胞株的凋亡,抑制其增殖.

目的 研究p53诱发转录因子FoxM1在卵巢癌中的表达及其临床意义.方法 首先在卵巢癌患者组织中初步鉴定p53和FoxM1表达;其次在A2780细胞培养过程中添加Nutlin-3、CHX、PFTα调控p53的表达,再鉴定FoxM1表达情况,分析两者相关性;最后,调控p53表达量后研究DPP促使A2790凋亡的能力.结果 在卵巢癌患者组织样品中,随着Ⅰ～Ⅳ期分级,p53和FoxM1表达量显著上升;添加Nutlin-3、CHX、PFTα后A2780细胞生长状况无明显的变化,其中CHX和PFTα组p53表达显著抑制,FoxM1也随之明显下降,Nutlin-3组p53表达显著上升,FoxM1也随之上升;在A2780细胞中添加DPP后,p53和FoxM1表达量均显著降低;上调p53表达后,A2780对DPP的敏感性显著增强,诱导细胞凋亡效果明显.结论 在卵巢癌细胞中,p53诱发FoxM1的表达,此外p53和FoxM1参与DPP诱导卵巢癌细胞的凋亡途径.