目的 研究胆固醇(CH)对脂微球(LM)与人血清白蛋白(HSA)形成蛋白晕的影响.方法 采用高速剪切-高压均质两步乳化法制备LM及含CH的CH@LM后,分别将相同体积但不同浓度(8、12、24、36 μmol·L-1)的HSA溶液与等体积不同质量浓度(10.76、15.37、26.90、35.87、53.80 mg·mL-1)的LM及CH@LM(以LM计)用恒温震荡器孵育不同时间,采用尺寸排阻色谱法分离出含有HSA蛋白晕的LM-HSA和CH@LM-HSA复合物以及过剩的HSA.通过粒径仪检测粒径及聚合物分散性指数(PDI),紫外可见分光光度计检测蛋白晕复合物的紫外图谱,荧光酶标仪检测蛋白晕复合物荧光图谱,分子对接研究油相中辅料的主要成分与HSA的结合能、油相中各辅料之间的结合能,并采用考马斯亮蓝染色对蛋白晕复合物进行表征.结果 LM、CH@LM自身稳定性较好,LM与HSA之间存在相互作用,所形成复合物的粒径及PDI具有时间及浓度相关性;加入CH后改变了复合物的粒径随时间的变化模式,同时减弱了由于LM浓度变化引起的与蛋白质之间相互作用的变化.加入CH后HSA自身荧光淬灭程度增强,最大吸收波长蓝移程度增加,表明加入CH后增强了 LM与HSA的相互作用程度.CH与HSA的分子对接结合能绝对值最高,且有CH的油相中各辅料分子与分子间对接结合能均高于无CH参与组;LM-HSA及CH@LM-HSA均保留了 HSA的特征条带.结论 CH增强了 LM对HSA的吸附能力,CH与其他辅料分子和蛋白具有更强的结合能力可能是主要原因.

目的 获得可溶表达的GⅡ.2[P16]型诺如病毒(norovirus,NV)P蛋白,并分析其抗原特性.方法 通过优化合成GⅡ.2[P16]型NVP蛋白基因并克隆至pET-28a(+)载体上,构建重组质粒GⅡ.2-NV-pET-28a,转化DH5α感受态细胞,通过对表达菌种的优化,使P蛋白以可溶性形式表达.表达的P蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化后,采用Western blot法检测纯化蛋白抗原性;体积排阻高效液相色谱(size exclusion high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法检测抗原纯度;ELISA法鉴定抗原抗体结合能力.结果 重组BL21 Star(DE3)pLySs工程菌目的蛋白以可溶形式高表达,经亲和层析纯化后,GⅡ.2P蛋白纯度为95.53％,且抗原性较好.结论 用原核表达菌种成功制备了可溶性表达的NVP蛋白,并明确了 P蛋白的抗原性,为GⅡ.2[P16]型NV检测试剂盒和重组亚单位疫苗的研制奠定了基础.

目的:比较超速离心法和尺寸排阻色谱法提取干细胞外泌体的产率、纯度、生物活性和促骨修复能力的差异.方法:采用超速离心法和尺寸排阻色谱法提取骨髓间充质干细胞外泌体,对外泌体的粒径、外观形貌和标志蛋白进行鉴定表征.采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定外泌体中蛋白含量,并采用血管生成因子芯片对外泌体中成血管相关蛋白进行分析.采用划痕实验和小管形成实验评价外泌体体外促血管生成能力,进一步在大鼠骨缺损模型中评价外泌体对骨修复再生的效果.结果:单位体积上清液中,超速离心法所得外泌体(Exo-UC)质量低于尺寸排阻色谱法所得外泌体(Exo-SEC)质量.电镜下见Exo-SEC中杂质蛋白少于Exo-UC中的杂质蛋白.Exo-UC中检测到16种成血管蛋白,Exo-SEC中检测到的成血管蛋白种类和含量均少于Exo-UC.与Exo-SEC比较,Exo-UC能够显著促进血管内皮细胞迁移和小管形成,并显著提升大鼠骨缺损部位的骨体积百分比和骨矿物质密度.结论:超速离心法提取的干细胞外泌体促新生血管形成能力更强,骨修复效果更佳.

目的·利用冷冻电镜技术分析人源性赖氨酸乙酰转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7)的全长蛋白结构,获得人源KAT7的轮廓信息.方法·使用pGEX-4T1载体和人源KAT7全长基因构建重组蛋白表达质粒pGEX-4T1-GST-KAT7,在原核蛋白表达体系BL21(DE3)中表达KAT7蛋白,使用GST亲和层析获得GST-KAT7重组蛋白;在利用TEV蛋白酶去除GST蛋白标签后,通过HiLoad 16/600 Superdex 75 pg体积排阻色谱进一步分离纯化KAT7蛋白.将获取的蛋白样品利用蛋白质印迹法(Western blotting)对KAT7进行鉴定,使用负染电镜筛选样品并初步观察蛋白形貌;使用冷冻电镜收集数据,利用冷冻电镜数据分析软件CryoSparc挑选蛋白颗粒并分析KAT7全长蛋白的空间结构;通过UCSF Chimera软件将蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)中KAT7的MYST结构域模型(5GK9)、AlphaFold预测模型与生成的结构模型进行匹配分析.结果·利用亲和层析成功纯化人源性KAT7的全长蛋白,并通过体积排阻色谱获得高纯度的KAT7蛋白;在通过Western blotting鉴定KAT7后,利用负染电镜、冷冻电镜及单颗粒重构技术初步解析了KAT7全长蛋白的空间结构,并通过三维优化处理获得了分辨率约为10A的初步三维结构模型;KAT7全长蛋白空间结构呈不规则的半环状,已有的MYST结构域模型(PDB:5GK9)可匹配入KAT7全长模型的C端部分,调整后的AlphaFold预测模型也可匹配KAT7全长结构模型.结论·利用冷冻电镜技术初步分析了人源性KAT7的全长蛋白空间结构模型.

目的 制备针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)IgA单克隆抗体,对其表达条件进行优化以提高表达量,并初步探讨IgA抗体在抗SARS-CoV-2中的效应.方法 将编码IgA1-F61抗体序列的质粒与聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)转染试剂混合后转染EXPi293F?细胞,瞬时表达抗体蛋白;通过优化重链(heavy chain,He)、轻链(light chain,Lc)、J链(joining chain,Jc)比例、质粒与PEI比例、转染后收获时间确定单体IgA1(monomeric IgA1,mIgA1)-F61 及二聚体IgA 1(dimeric IgA1,dIgA1)-F61 在EXPi293F?细胞中的最佳培养条件以及最佳表达量.将转染后上清经亲和层析纯化后,BCA法测定浓度,SDS-PAGE及体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)法分析抗体表达完整性及纯度,假病毒中和试验检测抗体中和活性.结果 当He与Lc比例为1∶2、质粒与PEI比例为1∶3、转染后5d收获上清时,mIgA1-F61最高表达量为123.45 μg/mL,纯化后抗体纯度达95％以上;He∶Lc∶Jc为1∶2∶1时,可获得最大纯度的dIgA1-F61,达90％以上.针对OmicronBA.4/5的假病毒中和试验结果显示,dIgA1-F61呈现优于IgG-F61的中和活性,其最大半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)降低了4倍左右.结论 成功表达了重组抗SARS-CoV-2单克隆抗体mIgA 1-F61和dIgA 1-F61,纯度较高,且dIgA 1在体外展现出优于IgG的中和活性.

该研究根据麻杏石甘汤中胶体颗粒尺寸不同对其进行分离、表征、含量测定及抗病毒药效研究.采用超滤法将麻杏石甘汤的混合胶体相态初步拆分为小胶体颗粒段(S)、中胶体颗粒段(M)、大胶体颗粒段(B),并用体积排阻色谱法进一步精细拆分,动态光散射法(DLS)及透射电镜法(TEM)表征分离后胶体颗粒的大小及形貌.UPLC-MS/MS测定不同胶体相态中麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸含量,EDTA络合滴定钙(Ca2+)含量.最后,滴鼻法建立呼吸道合胞病毒(RSV)感染小鼠模型,实验设空白组、模型组、利巴韦林组、麻杏石甘汤(MC)组、S组、M组、B组,灌胃给药治疗,考察小鼠肺组织病理变化及脏器指数.研究结果显示,麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸及Ca2+含量在不同胶体段中分布并不均匀,其中B段是除Ca2+外其他3种成分占比最高的部分,分别占全方的46.35％、53.72％、92.36％.体积排阻色谱法分离到粒径在100～500 nm的形貌均一的胶体颗粒.与S、M段相比,B段能提高RSV感染小鼠的肺指数抑制率(38.31％)、脾指数及胸腺指数,并改善小鼠肺组织炎症细胞浸润及肺损伤情况.麻杏石甘汤中的复杂成分通过加热形成大小不一、形态各异的胶体颗粒,麻黄碱、苦杏仁苷、甘草酸、Ca2+等小分子活性成分都不同程度地参与组装.麻杏石甘汤中发挥抗病毒作用的主要物质基础就是加热过程中活性成分组装产生的具有一定粒径的胶体颗粒.

目前,流感疫苗血凝素(hemagglutinin,HA)含量最常用的检测方法仍为单向免疫扩散法(single-radial immuno-diffusion,SRID),但该方法所需标准品制备耗时较长,通常需要2～3个月.在大流行流感发生初期无法获得标准参考品时,如何精确定量分析HA,一直是HA含量检测面临的难题.高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)具有快速、灵敏度高、重复性较好以及准确性高的特点,利用不同的分离原理可快速测定HA含量,在流感疫苗HA含量检测方面已得到很多应用.本文对HPLC在流感疫苗HA含量检测中应用的研究进展作一综述.

目的 对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(human recombinant neutrophil inhibitory factor and hiru-log hybrid,TNHH)的处方及工艺进行筛选和优化,并考察其稳定性.方法 以单因素试验结果为依据,pH范围、甘露醇用量、聚维酮K30用量为自变量,高分子蛋白含量为响应值,采用CCF响应曲面设计试验,分析各自变量及其交互作用对注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白中高分子蛋白含量的影响,筛选出最优处方.为了方便操作,对最优处方调整后制备中试规模3批样品,分别置于40 ℃、相对湿度(relative humidity,RH)75％条件下2、4周,2～8 ℃条件下 3、6个月,取样,检测外观、pH、反相高效液相色谱(reversed phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)纯度和体积排阻高效液相色谱(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)纯度,验证该处方和工艺的稳定性.结果 筛选出的最优处方为:pH 4.9826,甘露醇用量7.9864％,聚维酮K30用量1.9027％,最终调整为pH 5.0,甘露醇用量8.0％,聚维酮K30用量2.0％.采用优化处方和工艺制备的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂质量稳定,符合临床用药要求.结论 优选的注射用重组白细胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白制剂处方工艺合理,适合工业化生产.

目的 比较抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单克隆抗体酸性电荷异构体、原液及纯化工艺中阳离子交换层析预洗脱杂质质量差异,为细胞培养工艺研究和纯化工艺参数的调整提供参考.方法 采用体积排阻色谱法(size exclusion chromatography,SEC)检测供试品单体、聚体和残体含量;非还原/还原毛细管电泳-十二烷基磺酸钠(capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate,CE-SDS)法检测供试品电泳纯度;弱阳离子交换色谱法(weak cation exchange chromatography,CEX)检测供试品电荷异构体分布;毛细管等电聚焦(capillary iso-electric focusing,cIEF)法测定供试品等电点;细胞增殖抑制法测定供试品生物学活性.结果 SEC检测结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的单体含量分别为54.44％、99.08％和99.80％,残体含量分别为44.33％、0.61％和0.非还原CE-SDS结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的主峰含量分别为53.93％、90.83％和95.83％,小分子杂质含量分别为46.07％、9.17％和4.17％;还原CE-SDS结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的轻、重链百分含量分别为78.00％、96.80％和98.85％.CEX检测结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的主峰含量分别为2.60％、16.77％和66.46％,酸性峰含量分别为97.40％、82.53％和25.92％.cIEF检测结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的主峰含量分别为3.21％、18.17％和33.20％,酸性峰含量分别为94.21％、80.18％和64.38％,pI范围分别为6.40 ～8.85、7.69 ～ 8.69和7.94～ 8.69.生物活性测定结果显示,预洗脱杂质、酸性异构体和原液的比活性分别为0.45×104、1.02×104和0.94× 104U/mg.结论 HER2单克隆抗体酸性组分大部分由于单克隆抗体片段化造成;酸性电荷异构体的存在对HER2单克隆抗体的活性影响并不显著.

该研究以产自甘肃徽县太白乡的楤木根皮多糖(ACP)为材料,通过氯磺酸-吡啶法(CSA-Py)合成了楤木根皮多糖硫酸酯(SACP).通过响应面(RSM)实验确定的最佳反应条件:CSA/Py为2.53,反应时间为5.23 h,反应温度为61.25℃,DS理论最大值为0.57.通过红外光谱分析(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)对产物进行表征,SACP结构中已引入硫酸基团,S以S6+形式存在.气相色谱-质谱联用法(GC-MS)检测显示,SACP由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成.采用体积排阻色谱-激光光散射联用法(SEC-LLS)测得的平均分子量(Mw)显示,酸性反应导致Mw降低.体外抗氧化活性发现,SACP有极好的清除O-2·的能力,有较好的清除DPPH自由基、·OH自由基的能力,还原力很强,对Fe2+有较好的螯合能力,具有浓度依赖性.从构效关系来看,清除DPPH自由基、·OH自由基、O-2·自由基以及还原力的能力均与DS呈正相关.上述研究表明了ACP及SACP的化学结构以及化学修饰对ACP抗氧化活性的影响.