目的 探讨含 OTU 结构域的泛素醛结合蛋白 2(OTUB2)影响RNA解螺旋酶 54(DDX54)的活性及其对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成和结直肠癌(CRC)细胞活力、侵袭的影响.方法 分离CRC患者和健康对照组的外周血中性粒细胞,并使用佛波酯(PMA)或脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)刺激中性粒细胞4 h;Western blot检测NETs标记物髓过氧化物酶(MPO)和瓜氨酸组蛋白H3(Cit-H3)的表达;干预SW480 细胞中OTUB2 或DDX54 的表达并将其和中性粒细胞共培养,细胞分为如下组:对照组(不做任何处理),NETs 组、vector 组、OTUB2 组、NETs+si-OTUB2 组(SW480 细胞、转染了vector、OTUB2 过表达质粒和si-OTUB2的SW480 细胞分别与 PMA 处理的中性粒细胞共培养),OTUB2+DNase Ⅰ组(转染了OTUB2 过表达质粒的SW480细胞与DNase Ⅰ处理的中性粒细胞共培养),si-OTUB2 组、OTUB2+si-NC 组和 OTUB2+si-DDX54 组(转染了 si-OTUB2、OTUB2 过表达质粒和 si-NC、OTUB2 过表达质粒和si-DDX54 的 SW480 细胞分别与中性粒细胞共培养).ELISA检测 SW480 细胞上清液中 MPO-DNA 复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度;MTT和Transwell检测SW480 细胞活力和侵袭能力;RNA测序筛选OTUB2 调控的下游基因并使用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫共沉淀(co-IP)和谷胱甘肽 S-转移酶(GST)亲和纯化(GST-pull-down)、His-tag pull-down实验验证 DDX54 和OTUB2 的相互作用.结果 与健康对照相比,CRC患者外周血中NETs的形成增加.与对照组相比,NETs组CRC细胞活力和侵袭增加(P<0.05).与vector组比较,OTUB2 组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度增加,细胞活力和侵袭增加(P<0.05);而与OTUB2 组比较,OTUB2+DNase Ⅰ组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度减少,细胞活力和侵袭减少(P<0.05).Co-IP 实验、GST pull down 实验和His-tag pull down实验表明OTUB2 和DDX54 之间存在相互作用.与 OTUB2+si-NC 组比较,OTUB2+si-DDX54 组MPO-DNA复合物相对表达量和Cit-H3 的浓度减少,细胞活力和侵袭减少(P<0.05).结论 去泛素化酶OTUB2 可以通过上调DDX54 的增加NETs的形成并促进CRC细胞活力和侵袭.

目的 探究去泛素化酶在单核细胞驯化免疫中的作用及机制.方法 Q-PCR检测单核细胞驯化免疫中去泛素化酶相关基因的表达情况;ELISA法检测去泛素化酶对驯化的单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响;双荧光素酶报告基因检测系统测定去泛素化酶对NF-κB信号通路的影响.双荧光素酶报告基因检测系统测定:UCHL1对NF-κB 信号通路的影响、UCHL1与NF-κB信号通路关键信号分子之间的作用及UCHL1影响NF-κB信号通路所依赖的酶活性;ELISA法检测UCHL1对单核细胞驯化作用中TNF-α分泌水平的影响.结果 去泛素化酶USP2、UCHL1、OTUB2和OTUD4在单核细胞驯化免疫中的表达量明显升高;去泛素化酶抑制剂可明显抑制驯化单核细胞中TNF-α的分泌水平;USP2、UCHL1、OTUB2、PSMD14 等可明显激活 NF-κB 信号通路,通过上述实验筛选出对NF-κB影响最为明显的UCHL1进行后续研究.UCHL1的表达明显影响NF-κB信号通路的激活;UCHL1的表达促进了由IκB-α、IKK-α或IKK-β介导的NF-κB的激活;UCHL1主要通过其泛素水解酶活性调控NF-κB信号通路;UCHL1抑制剂可明显减弱单核细胞的驯化作用.结论 自身免疫病中免疫复合物可以驯化单核细胞增强其敏感性,这种作用可通过UCHL1调节NF-κB信号通路的激活实现.

目的 探讨结直肠癌细胞在三维(3D)与二维(2D)培养环境下增殖能力的变化及机制.方法 SW480 结直肠癌细胞购自上海细胞库.将SW480 结直肠癌细胞分别进行壳聚糖-胶原水凝胶3D培养与细胞培养皿2D培养.光学显微镜观察细胞形态;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖情况;Western blot法检测3D与2D培养环境OTUB2 与PCNA蛋白表达;比较转染前后SW480 细胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表达、细胞增殖速率.结果 SW480 结肠癌细胞在2D环境培养24h后可圆形或卵圆形细胞贴壁,7 d后已贴壁的细胞慢慢伸展,呈短杆状;SW480 结肠癌细胞在壳聚糖-胶原水凝胶3D培养24h后呈3D球状生长,培养7d后可见细胞数量增多,细胞球变大.3D培养环境SW480 细胞增殖速率低于 2D培养环境,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot法检测结果显示,与 2D培养比较,3D培养环境培养后结直肠癌细胞系中OTUB2、PCNA蛋白表达均低于2D培养环境,差异均有统计学意义(P<0.05).转染后SW480 细胞OTUB2、PCNA基因和蛋白表达、细胞增殖速率均高于转染前,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 壳聚糖-胶原水凝胶 3D培养条件下结直肠癌细胞增殖速率减慢,其机制与调控OTUB2、PCNA表达有关.

目的:通过生物信息学手段分析原发性开角型青光眼(POAG)进展过程中调控铁死亡相关的关键基因,旨在进一步揭示铁死亡在POAG中的生物学机制.方法:从GEO数据库中获取小梁网来源的GSE27276 数据集,其中包括 19 个POAG小梁网组织样本和 17 个正常小梁网组织样本;下载FerrDb数据库整理的铁死亡相关基因,将GSE27276 数据集与铁死亡基因集进行映射,筛选POAG中铁死亡相关的预后差异表达基因(DE-FRGs)并进行相关性分析,进一步了解DE-FRGs的GO和KEGG通路富集.应用LASSO回归模型与SVM-RFE模型两种机器学习的算法筛选铁死亡相关POAG的关键基因,将两种模型的筛选结果取交集,获得最佳特征基因,使用受试者特征曲线(ROC)评估临床诊断能力;对最佳特征基因进行单基因基因组富集分析(GSEA)和变异分析(GSVA);借助视乳头来源的GSE2378 与GSE9944 数据集验证最佳特征基因的表达水平.结果:与正常小梁网组织相比,POAG 的小梁网组织有396 个铁死亡基因存在差异表达,其中 39 个为上调基因,64 个为下调基因,Spearman相关性分析显示上调基因和下调基因均有一定的相关性.GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异基因主要富集在氧化应激反应和铁死亡通路;通过LASSO和SVM-RFE算法将18 个DE-FRGs确定为关键基因,具有更高的诊断价值.GSEA和GSVA富集分析显示GDF15、MFN2 和 OTUB1 基因与谷胱甘肽代谢通路密切相关,其中MFN2 和OTUB1 分别在高表达组和低表达组中激活谷胱甘肽代谢通路.GSE2378 与GSE9944 数据集交叉验证明确视乳头标本中CREB1 的表达水平相对于正常视乳头样本显著升高,这与GSE27276数据集小梁网样本表达一致.结论:基于生物信息学分析挖掘得到 396 个 POAG 的DE-FRGs,通过构建机器筛选模型和外部数据集交叉验证,筛选出CREB1 有望成为潜在诊断生物标志物的最佳特征基因,为进一步深入阐明POAG铁死亡相关的分子机制和诊断提供靶点.同时筛选的基因还需要进一步体内、外实验验证,揭示铁死亡在POAG中的生物学机制.

目的 探讨卵巢肿瘤相关蛋白酶B1(OTUB1)基因的siRNA转染对脑胶质瘤细胞活力、凋亡及STAT3信号通路的影响.方法 Westernblotting检测OTUB1在人脑恶性胶质瘤U251、U87、BT325和M17细胞中的蛋白表达;U87细胞分为空白组(不做任何处理)、NC组(转染Control siRNA)和si-OTUB1组(转染OTUB1 siRNA),参照Lip2000转染试剂盒说明转染siRNA.Western blotting检测转染OTUB1-siRNA后OTUB1的蛋白表达,并选择抑制效果好的siRNA作为研究对象;MTT检测OTUB1-siRNA转染后的24～72 h细胞活力;流式细胞仪检测OTUB1-siRNA转染的48 h细胞凋亡率;Western blotting检测STAT3、磷酸化的STAT3及STAT3信号通路下游相关基因cyclinD1和Bcl-2的蛋白表达.结果 OTUB1在U251、U87、BT325和M17细胞中均呈现出阳性表达,在U87细胞中呈现出较高水平表达;OTUB1-siRNA转染后的U87细胞OTUB1的蛋白表达显著低于空白组和NC组(P<0.05);与NC组比较,si-OTUB1转染U87细胞24-72h的细胞活力均显著降低,转染48 h的细胞凋亡率显著升高,p-STAT3、cyclinD1和Bcl-2的蛋白表达均显著降低(P<0.05),而三组间STAT3的蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论 OTUB1在人脑恶性胶质瘤细胞高表达,抑制OTUB1表达后可明显降低脑胶质瘤细胞活力,诱导细胞凋亡,机制可能是通过下调STAT3信号通路实现的.

目的:探讨去泛素化酶OTUB1在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中的表达及对白血病细胞增殖、凋亡的影响.方法:通过生物信息学分析探讨OTUB1在急性髓系白血病患者中的表达及与预后的关系.使用CCK-8法检测OTUB1对白血病细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞周期和凋亡的影响,分光光度法检测对Caspase-3活性的影响.结果:GEPIA数据库分析显示OTUB1基因在AML患者中的表达显著升高(P<0.05),并且OTUB1高表达的AML患者总生存率明显降低[Logrank P=0.023,HR(high)=1.9,P(HR)=0.026].白血病HL-60细胞中使用siRNA干扰OTUB1表达后,细胞的增殖活力明显下降(P<0.05),处于G0/G1期的细胞明显增多(P<0.05),S期和G2/M期的细胞明显减少(P<0.05).下调OTUB1表达后HL-60细胞的凋亡率较对照组明显增加(P<0.05),细胞中Caspase-3的活性较对照细胞明显增强(P<0.05).结论:OTUB1在急性髓系白血病患者中高表达并且与预后负相关,其能促进白血病细胞的增殖,抑制其凋亡.

肿瘤转移是造成肿瘤患者死亡的主要原因.多种肿瘤转移被报道与蛋白质泛素化密切相关.近年来研究提示,蛋白质泛素化酶通过调控肿瘤转移相关通路关键因子表达影响肿瘤侵袭转移.文章对参与泛素化过程的UBE2C、FBXW5和FBXW7、STUB1、TRIM65、OTUB1等调控肿瘤转移的主要分子机制进行综述,为恶性肿瘤转移的逆转提供新思路.

目的 探讨含OTU结构域的泛素醛结合蛋白2(OTUB2)表达下调对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响.方法 采用Lipofectmine 2000转染试剂向MGC-803细胞中转染OTUB2小干扰RNA(si-OTUB2)序列(si-OTUB2组)和si-NC序列(si-NC组),以不进行任何转染的胃癌MGC-803细胞作为空白对照组.分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法(West-ern blot)检测细胞中OTUB2 mRNA及蛋白的表达水平.采用CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、AKT、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达水平.结果 与空白对照组和si-NC组比较,si-OTUB2组细胞中OTUB2 mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05),细胞增殖能力减弱(P<0.05),细胞迁移数和侵袭数减少(P<0.05),细胞中PCNA、N-cadherin和p-AKT蛋白表达水平降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05).结论 下调OTUB2可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭,其作用机制可能与抑制PI3 K/AKT信号通路有关.

目的 在体内外探讨小檗胺对肝癌细胞SMMC-7721的增殖、迁移的影响及其可能的作用机制.方法在体外,用MTT试验评价小檗胺对SMMC-7721 增殖的影响.划痕试验评价小檗胺对SMMC-7721 细胞迁移的影响,在体内,用移植肿瘤模型评价小檗胺对肿瘤的增长及转移的影响.用western blot试验检测小檗胺对OTUB1、p53、Bcl-2、Bax以及caspase3表达的影响.结果 MTT实验表明小檗胺以浓度依赖和时间依赖的形式抑制SMMC-7721细胞增殖;划痕试验表明小檗胺能够显著抑制SMMC-7721细胞的迁移.体内实验结果表明,小檗胺能够使肿瘤体积明显缩小,并且能够使肝脏表面的结节数明显减少,Western blot试验结果提示小檗胺能够明显下调OTUB1和Bcl-2/Bax的表达,上调cleaved-caspase-3/caspase-3和p53的表达.结论 小檗胺能够在体内外SMMC-7721细胞增殖与侵袭转移,其作用机制可能与调节OTUB1的表达有关.

目的:探讨小檗胺对肺癌细胞A549的增殖、侵袭转移和凋亡的影响及可能的作用机制.方法:用MTT试验和EdU试剂盒检测小檗胺对A549细胞增殖的影响,划痕试验和Transwell试验检测小檗胺对A549细胞侵袭转移的影响,台盼蓝染色实验和Cell Death Detection Elisa Kit检测小檗胺对A549细胞凋亡的影响;Western blotting检测小檗胺对A549细胞中卵巢肿瘤相关蛋白酶B1(OTUB1)、鼠双微体2基因(MDM2)、p53及半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响.结果:小檗胺以浓度依赖和时间依赖的形式抑制A549细胞增殖,在小檗胺处理A549细胞72h时,小檗胺抑制细胞增殖的IC50为(22.7±2.3)μmol/L.与对照组比较,小檗胺能够明显诱导A549细胞凋亡(P＜0.05).划痕试验和Transwell试验结果表明小檗胺能够明显抑制A549细胞的侵袭转移(P＜0.05).West-ern blotting结果提示小檗胺能够明显下调OTUB1、MDM2的表达(P＜0.05),上调p53和cleaved-Caspase-3/Cas-pase-3的表达(P＜0.05).结论:小檗胺能够抑制A549细胞增殖与侵袭转移,诱导细胞凋亡,这种作用可能是通过调控OTUB1和MDM2-p53信号通路来实现的.