目的:探讨中国汉族人群糖尿病视网膜病变（DR）易感基因外显子区候选致病位点。方法:本研究为病例对照研究。回顾性分析2015年1月至2018年9月在南京大学医学院附属鼓楼医院明确诊断的2型糖尿病（T2DM）患者，病例组为101例DR患者，对照组为103例非DR患者。收集患者的一般资料和实验室检查结果。采用FastTarget目标区域富集二代测序技术对中国人群DR易感基因TBC1D4、COMMD6、UCHL3、LRP2、BBS5、ARL4C和SH3BP4外显子区进行捕获测序。采用独立样本 t检验和χ2检验评估病例组和对照组的一般人口学特征。采用logistic回归和计数法评估常见、罕见变异与DR发生之间的关联。对于鉴定的DR相关变异，采用功能注释来评估其潜在的生物学功能。 结果:病例组的年龄低于对照组，糖化血红蛋白水平高于对照组，病程比对照组短，差异均有统计学意义（ P<0.05）。在82个常见变异中，通过logistic回归分析发现4个位点与DR风险关联（ P<0.05），分别为LRP2基因rs13417389、LRP2基因rs2229267、LRP2基因rs2229268、LRP2基因rs886055072。鉴定了14个DR相关功能性罕见变异，其联合注释相关损耗（CADD）评分均>20，分别为LRP2基因rs764804647 G>A、LRP2基因rs538396567 T>A、LRP2基因Chr2∶170010984 T>A、LRP2基因Chr2∶170050282 C>A、LRP2基因Chr2∶170129538 T>A、LRP2基因Chr2∶170129538 T>C、LRP2基因Chr2∶170129539 G>A、LRP2基因Chr2∶170129539 G>T、LRP2基因rs754796717 G>C、LRP2基因rs529409328 C>G、UCHL3基因Chr13∶76135016 A>G、TBC1D4基因Chr13∶75876471 C>A、TBC1D4基因rs201459702 T>C、SH3BP4基因Chr2∶235950303 G>A。 结论:发现的14个DR相关功能性罕见变异可作为中国汉族人群DR候选致病位点。

目的:研究缺氧诱导的泛素羧基末端水解酶L5 (UCHL5）在调节宫颈癌Hela细胞辐射敏感性中的作用。方法:以宫颈癌Hela细胞为研究对象，1% O 2条件下培养观察UCHL5表达水平的变化。采用Western blot和实时定量聚合酶链反应（PCR）检测慢病毒载体感染Hela细胞后稳定调变UCHL5的效率，转录本分为空白对照组、过表达对照组、过表达UCHL5组转录本1~4和沉默对照组、沉默UCHL5组转录本1~2。将实验所用的细胞分为过表达对照组、过表达UCHL5组、沉默对照组和沉默UCHL5组。采用流式细胞术检测8 Gy γ射线照射48 h后细胞的凋亡率；采用细胞克隆形成实验检测0、2、4、6 Gy γ射线单次照射培养2周后4组细胞的克隆形成率；采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）实验检测4组细胞培养1周后的增殖率以及联合0、2、4、6、8、10 Gy γ射线照射后的增殖率。使用基因表达谱数据动态分析癌症基因组图谱数据库宫颈癌组织和正常组织中抗缺氧诱导因子1α（HIF-1α）与UCHL5表达的相关性。采用双荧光素酶报告基因实验观察HIF-1α对UCHL5的激活作用。组间比较采用单样本 t检验，采用Pearson检验进行相关性分析。 结果:缺氧可诱导宫颈癌Hela细胞UCHL5的表达。Western blot和实时定量PCR结果显示，感染后的Hela细胞可显著上调或下调UCHL5的表达，其中，过表达UCHL5组转录本2和沉默UCHL5组转录本2的表达均较高，所以选择此2种转录本进行后续实验。克隆形成实验结果显示，与接受相同剂量照射的过表达对照组相比，上调UCHL5增加了Hela细胞的克隆形成率，在0、2、4、6 Gy剂量照射后克隆形成率的差异均有统计学意义（ t=14.16、19.22、8.76、6.79，均 P<0.05）。流式细胞术结果显示，与沉默对照组相比，沉默UCHL5促进了Hela细胞的凋亡（ t=10.29， P<0.05），增加了γ射线诱导的细胞凋亡率( t=52.01, P<0.05)。MTT实验结果显示，与过表达对照组相比，上调UCHL5可升高宫颈癌Hela细胞的增殖率，增殖率在第3天时差异有统计学意义( t=3.905， P<0.05)；与过表达对照组相比，等剂量照射UCHL5上调组升高了受照细胞的增殖率，在剂量为6、8、10 Gy时，细胞的增殖率差异均有统计学意义（ t=3.40、4.06、3.68，均 P<0.05）。宫颈癌组织中HIF-1α表达水平和UCHL5表达水平呈正相关（ R=0.31， P<0.01），双荧光素酶报告基因结果显示HIF-1α结合并激活UCHL5启动子的活性，其活性增加了2.5倍（ t=30.47， P<0.05）。 结论:缺氧条件下，宫颈癌Hela细胞中UHCL5的诱导表达降低了细胞的辐射敏感性，其潜在的机制可能与HIF-1α转录激活UCHL5的表达有关。

目的:探讨泛素羧基末端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase-L1,UCHL1)通过调控缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)介导的代谢重编程促进肺腺癌细胞的增殖和转移.方法:免疫组化和实时定量聚合酶链反应检测肺腺癌组织和细胞中UCHL1和HIF-1的表达;Kaplan-Meier Plotter和UALCAN数据库分析了 UCHL1和HIF-1的表达量与患者生存期的关联,并进一步分析了二者在不同临床病理等级以及淋巴转移患者肿瘤组织中的表达;克隆形成、迁移和侵袭评估肺腺癌HCC4006细胞转染UCHL1 siRNA后恶性生物学行为变化;Western Blot检测沉默UCHL1后肿瘤细胞糖酵解信号通路IL-6/STAT3标志分子的表达.结果:免疫组化、实时定量聚合酶链反应以及相关性分析,结果显示肺腺癌组织和细胞中UCHL1和HIF-1的表达较癌旁组织和正常人支气管上皮细胞中显著增加,且二者表达水平呈正相关(P＜0.01),与Oncomine数据库中UCHL1和HIF-1的表达趋势相一致.生信分析结果显示,UCHL1和HIF-1异常高表达与肺腺癌患者的生存期呈负相关、而与患者的病理等级和淋巴结转移呈正相关(P＜0.01).转染UCHL1 siRNA的肺腺癌HCC4006细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力较对照组细胞显著降低,同时细胞的耗氧量显著增加,并抑制细胞中LDH活性和LD分泌(P＜0.01).Western Blot结果显示,沉默UCHL1可抑制HIF-1表达,并降低缺氧介导的肿瘤细胞糖酵解信号通路IL-6/STAT3标志分子的表达(P＜0.01).结论:肺腺癌细胞通过UCHL1-HIF-1轴介导的代谢重编程获得较强的增殖和转移表型,为靶向该基因网络的治疗提供了理论依据.

目的 探究去泛素化酶在单核细胞驯化免疫中的作用及机制.方法 Q-PCR检测单核细胞驯化免疫中去泛素化酶相关基因的表达情况;ELISA法检测去泛素化酶对驯化的单核细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的影响;双荧光素酶报告基因检测系统测定去泛素化酶对NF-κB信号通路的影响.双荧光素酶报告基因检测系统测定:UCHL1对NF-κB 信号通路的影响、UCHL1与NF-κB信号通路关键信号分子之间的作用及UCHL1影响NF-κB信号通路所依赖的酶活性;ELISA法检测UCHL1对单核细胞驯化作用中TNF-α分泌水平的影响.结果 去泛素化酶USP2、UCHL1、OTUB2和OTUD4在单核细胞驯化免疫中的表达量明显升高;去泛素化酶抑制剂可明显抑制驯化单核细胞中TNF-α的分泌水平;USP2、UCHL1、OTUB2、PSMD14 等可明显激活 NF-κB 信号通路,通过上述实验筛选出对NF-κB影响最为明显的UCHL1进行后续研究.UCHL1的表达明显影响NF-κB信号通路的激活;UCHL1的表达促进了由IκB-α、IKK-α或IKK-β介导的NF-κB的激活;UCHL1主要通过其泛素水解酶活性调控NF-κB信号通路;UCHL1抑制剂可明显减弱单核细胞的驯化作用.结论 自身免疫病中免疫复合物可以驯化单核细胞增强其敏感性,这种作用可通过UCHL1调节NF-κB信号通路的激活实现.

为探究核糖体蛋白RPS6 亚基肽段对S180 肿瘤细胞基因表达的影响及抑制肿瘤细胞的关键分子和信号通路,以S180 荷瘤小鼠为模型,用RPS6 亚基肽段处理S180 荷瘤小鼠,对S180 肿瘤细胞进行Illumina测序获得差异表达的基因,并对这些差异基因进行GO和KEGG分析.基因表达结果显示,RPS6 亚基肽段会导致mt-Cytb、mt-Nd1、Rpl13 基因表达降低,阻碍S180 肿瘤细胞的氧化磷酸化过程.GO分析结果显示,RPS6 亚基肽段抑制肿瘤细胞关键门类集中于质膜和质膜外侧组成成分的变化及免疫反应调节和免疫细胞的激活.差异基因结果显示,RPS6亚基肽段通过增强PRL/PRLR信号,上调Uchl1 基因表达,诱导肿瘤细胞周期停滞.KEGG通路富集分析结果显示,穿孔素(PRF1)和颗粒酶B(GZMB)表达诱导细胞凋亡,同时自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)介导的细胞毒性与NF-κB信号通路信号增强,IFN-γ和TNF-α表达上调共同参与RPS6 亚基肽段作用下的S180 肿瘤细胞凋亡,抑制S180 肿瘤细胞增殖.RPS6 亚基肽段导致S180 肿瘤细胞细胞周期停滞,并诱导自然杀伤细胞介导的细胞毒性及NF-κB信号通路的上调导致S180 肿瘤细胞凋亡,为RPS6 亚基肽段在抗肿瘤研究的应用提供一定的理论依据.

[目的]比较4种常用的SD大鼠肩周炎模型炎症因子、纤维化因子、神经内分泌因子表达,筛选有效的肩周炎造模方法.[方法]将100只SD大鼠随机分为5组,即风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组、石膏制动模型组、空白对照组,每组20只.分别在造模完成后第1、2、4、8周取材,苏木素-伊红(HE)染色法观察肩关节软骨组织病理学形态,免疫组织化学染色法检测肩关节软骨组织炎症因子[环氧合酶1(COX-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)],纤维化因子[转化生长因子β(TGF-β)],神经内分泌因子[降钙素基因相关肽(CGRP)受体成分蛋白(CRCP)、泛素羧基末端水解酶(UCHL)]表达,比较不同造模方法效果的差异.[结果]HE染色结果显示,4个模型组肩关节软骨细胞减少,关节表面软骨纤维化.免疫组织化学染色结果显示:4个模型组COX-1表达最高值均高于空白对照组最高值.风寒湿刺激模型组、手术损伤模型组TNF-α表达在造模完成后第1～2周高于空白对照组,持续机械劳损加冰敷模型组在造模完成后第1～4周均高于空白对照组,石膏制动模型组在造模完成后第1～8周均高于空白对照组.持续机械劳损加冰敷模型组、石膏制动模型组TGF-β在造模完成后第2周时最高值大于其他各组最高值.风寒湿刺激模型组、持续机械劳损加冰敷模型组、手术损伤模型组CRCP表达在造模完成后第2周最高值高于空白对照组,石膏制动模型组在第1周最高值高于空白对照组.4个模型组在造模完成后第1、2、4、8周UCHL表达均高于空白对照组.[结论]石膏制动模型在炎症因子表达稳定性方面优于其他肩周炎模型;持续机械劳损加冰敷模型、石膏制动模型在肩关节纤维化相关因子稳定表达方面优于其他模型;手术损伤模型和石膏制动模型在肩关节致痛因子表达方面优于其他模型.

目的 通过基因表达综合(GEO)数据库微阵列分析,筛选出重要的肺纤维化相关泛素化基因,探讨其在肺纤维化大鼠肺组织中表达情况及作用.方法 采用GEO数据库中GSE47460和GSE70866两个数据集,利用R语言limma包获取肺纤维化组和正常对照组间差异表达基因(DEGs).从DEGs中选出泛素化相关基因,利用Cytoscape软件筛选关键(Hub)基因,并对后者进行GO和KEGG富集分析、Kaplan-Meier分析差异表达基因生存率.同时,构建博来霉素(BLM)诱导肺纤维化大鼠模型,通过蛋白免疫印迹(WB)检测肺纤维化大鼠肺组织Hub基因表达情况.结果 筛选出38个泛素化相关的DEGs,5个是泛素化相关的Hub基因,其中UCHL1是肺纤维化较好的生存预测基因,其在肺纤维化组大鼠肺组织中的表达也较正常组升高(P<0.05),抑制UCHL1可明显改善肺纤维化.结论 泛素化相关Hub基因可能参与肺纤维化进程,其中UCHL1在肺纤维化过程中发挥重要作用,有望成为肺纤维化治疗的分子靶点和诊断性生物标志物.

目的:探讨三叶青黄酮对非小细胞肺癌A549细胞增殖抑制作用及其机制.方法:采用MTT法检测三叶青黄酮对A549细胞增殖的抑制作用;酶标仪检测细胞蛋白酶体和DUB活性;Real-time PCR和Western blot法检测细胞泛素-蛋白酶体途径相关蛋白ub-prs、USP14、UCHL5、POH1等表达变化.结果:体外实验MTT法检测三叶青黄酮对非小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用,显示三叶青黄酮各浓度组的抑制率比较,差异具有统计学意义,并呈剂量依赖性.酶标仪检测结果显示随三叶青黄酮浓度升高,细胞蛋白酶体和DUB活性逐渐降低,呈明显的量-效关系.Real-time PCR和Western blot法检测表明三叶青黄酮可以上调A549细胞中ub-prs蛋白表达,下调USP14、UCHL5、POH1蛋白表达,呈剂量依赖性.结论:三叶青黄酮对非小细胞肺癌A549细胞具有明显抑制增殖作用,其机制可能与调节泛素-蛋白酶体途径有关.

泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1,UCHL1)是一种去泛素化酶,特异性表达于脑与生殖腺,具有去泛素化活性、稳定细胞内泛素单体的功能.为确定UCHL1在脊椎动物中是否普遍存在,从而选择身体构造更简单的模式动物研究其生物学功能,通过生物信息学手段分析脊椎动物门的11种生物中基因UCHL1的分子进化情况,分析显示UCHL1基因组长度在进化过程中变化较大,但外显子个数变化较小,蛋白氨基酸残基数目也基本维持在223 aa左右.分析结果表明,mRNA有不同的剪接方式,但氨基酸序列在进化上是高度保守的,UCHL1蛋白活性位点同源性高达90％,该结果证明了蛋白UCHL1的功能对于物种正常生存是必须的.

本研究旨在探索泛素羧基末端水解酶L1 (ubiquitin C-terminal hydrolase-L1,UCHLl)对非小细胞肺癌细胞系A549细胞的作用.用CRISPR-CAS9基因编辑技术构建UCHL1基因敲除的A549细胞株,用RT-PCR和Western blot检测A549细胞中UCHL1基因敲除情况,用CCK-8检测细胞增殖能力的变化,用流式细胞仪检测细胞周期的变化,用CCK-8检测A549细胞对顺铂药物敏感性的改变,用划痕与Transwell实验检测A549细胞迁移能力的变化,用Western blot检测与A549细胞迁移有关的蛋白表达变化.结果显示,使用CRISPR-CAS9技术构建的基因移码突变导致A549细胞株UCHL1 mRNA和蛋白缺失,UCHL1基因功能缺失后A549细胞增殖和各细胞周期比例没有明显变化,但对顺铂的药物敏感性降低,迁移能力下降,Erk 1/2蛋白磷酸化水平升高.以上结果提示,UCHL1基因功能缺失可导致A549细胞顺铂耐药性提高,细胞迁移能力降低,其机制可能涉及Erk1/2信号通路的激活.