目的 研究神牡安神胶囊治疗神经衰弱引起失眠的药效物质基础及潜在作用机制.方法 运用UPLC-QE-Orbitrap-MS并结合文献,对神牡安神胶囊的主要化学成分进行分析鉴定;通过TCMSP数据库及文献查阅对神牡安神胶囊的潜在有效成分进行筛选及补充;通过Swiss Target Prediction数据库预测活性成分潜在靶点;搜索OMIM、GeneCards及TTD数据库获取失眠症相关靶点;使用Venny软件收集成分靶点-疾病靶点交集,在Cytoscape软件中构建药物-成分-靶点网络图;利用STRING平台构建PPI网络,借助Metascape数据库对交集靶点进行GO富集分析与KEGG通路分析,利用Cytoscape构建成分-靶点-通路图.进一步建立对氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠小鼠模型,通过延长戊巴比妥钠睡眠时间实验考察神牡安神胶囊改善失眠动物模型睡眠的作用,通过ELISA法检测各组小鼠血清中5-羟色胺(5-HT)水平,考察神牡安神胶囊改善睡眠的可能机制.结果 通过与数据库对比、文献分析以及质谱裂解规律解析,从神牡安神胶囊样品中鉴定出40个化合物;通过网络药理学共筛选出122个候选成分和917个预测靶点,与失眠共同靶点185个,关键靶点主要涉及TP53、EP300、HDAC1、TNF、APP等;KEGG富集分析预测神牡安神胶囊主要通过神经退行性病变相关信号通路(pathways of neurodegeneration-multiple diseases)、多巴胺能突触信号通路(dopaminergic synapse)、帕金森病信号通路(Parkinson disease)及5-羟色胺能神经突触信号通路(serotonergic synapse)等信号通路发挥治疗失眠作用.延长戊巴比妥钠睡眠时间实验中,与模型组相比,神牡安神胶囊中、高剂量组小鼠睡眠时间显著延长(P＜0.01);小鼠血清中5-HT的含量也明显升高(P＜0.05).结论 初步明确了神牡安神胶囊的化学组成及其治疗神经衰弱失眠症的作用机制,其改善小鼠失眠作用可能是通过激活脑内抑制性单胺类神经递质,增加中枢对睡眠中枢的控制而发挥作用.

目的 探讨苏格木勒-4汤中两种成分荷叶碱(NUC)与四氢小檗碱(THB)对PCPA失眠模型小鼠的抗失眠作用.方法 采用PCPA诱导小鼠失眠模型,分别以NUC与THB低、高剂量干预后,对比观察各组小鼠一般状态;戊巴比妥钠睡眠实验检测睡眠潜伏期与睡眠持续时间;网络药理学与分子对接实验预测潜在靶点与通路;ELISA及Western Blot检测相关指标.结果 与空白组相比,各造模组小鼠体质量下降,昼夜节律紊乱,兴奋性和攻击性增强,差异有统计学意义(P＜0.05).药物干预可显著改善小鼠一般状态,恢复体质量,缩短睡眠潜伏期,延长睡眠持续时间,差异有统计学意义(P＜0.05).网络药理结果显示NUC与THB改善失眠的机制可能与神经活性配体-受体相互作用、五羟色胺(5-HT)能突触、多巴胺(DA)能突触等多条信号通路有关,且NUC和THB可与5HT1A和DAT蛋白结合,可下调失眠小鼠脑组织中DA水平,上调5-HT、γ氨基丁酸(GABA)水平,高剂量NUC有增加5HT1A表达和降低DAT表达的趋势,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NUC与THB可改善PCPA导致的失眠,可能为苏格木勒-4汤干预失眠的有效成分.

目的:探讨SMT(S)改善小鼠失眠及失眠引起的继发性认知障碍、焦虑、免疫低下的作用机制.方法:应用PCPA建立失眠小鼠动物模型,通过行为学实验以及检测血清中神经递质含量,考察SMT(S)的镇静催眠作用以及改善焦虑和学习记忆能力;通过NK细胞杀伤实验和T淋巴细胞转化实验检测增强免疫功能的能力,应用Western blotting检测PI3K/Akt信号通路蛋白表达情况.结果:SMT(S)可减少失眠小鼠在旷场中央格停留时间、移动距离及平均速度,缩短在水迷宫中的上岸潜伏期及总路程;增加血清中5-HT含量以及减少DA和NE的含量;升高NK细胞杀伤率及淋巴细胞刺激指数;增加了 PI3K、Akt、mTOR蛋白在失眠小鼠脑组织中的表达.结论:SMT(S)可有效预防失眠,明显改善失眠后小鼠的学习记忆能力及焦虑情况,并增强小鼠的免疫功能,其分子机制与调节PI3K/Akt信号通路相关.实验表明SMT(S)通过调节PI3K/Akt信号通路治疗失眠及失眠引起的继发性认知障碍、焦虑、免疫力低下的作用.

目的:基于p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路探讨针刺原俞配穴法治疗失眠的作用机制.方法:将50只大鼠随机分成五组,即空白组、模型组、原穴组、背俞组、原俞配组,每组10只.除空白组外,其余四组采用腹腔注射氯苯丙氨酸混悬液(PCPA)造模,造模成功后对各组实施相应干预措施,空白组与模型组大鼠仅抓取、不予针刺治疗;原穴组针刺双侧"神门""太冲";背俞组针刺双侧"心俞""肝俞";原俞配穴组针刺双侧"神门""太冲""心俞""肝俞".治疗结束后观察各组大鼠一般状态,检测大鼠血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、下丘脑组织p38MAPK蛋白及mRNA的表达.结果:与空白组相比,模型组大鼠体重下降显著,皮毛晦暗凌乱,焦躁,血清IL-6、TNF-α浓度和下丘脑中的p38MAPK的mRNA、蛋白明显升高(P＜0.01).与模型组相比,原穴组、背俞组、原俞配组大鼠体重下降较少,皮毛凌乱,精神状态有明显改善,焦躁症状明显减轻,血清中IL-6、TNF-α浓度和下丘脑中的p38MAPK的mRNA表达量和蛋白水平明显下降(P＜0.05),且原俞配穴组效果优于原穴组、背俞组.结论:针刺可以改善失眠大鼠的睡眠情况,且原俞配穴效果更佳,其可能是通过抑制p38MAPK信号通路,降低炎症反应发挥作用.

目的 通过观察对氯苯丙氨酸(PCPA)失眠大鼠模型在造模成功后一周内,各类行为学实验中的学习记忆能力改变,验证 PCPA失眠模型稳定性.方法 30 只 SD大鼠随机均分为空白组和模型组,空白组正常饲养,对模型组大鼠腹腔注射 PCPA建立失眠模型,建模后第 1 周进行 Morris水迷宫实验等 5 项大鼠行为学监测.结果 与空白组比较,模型组大鼠睡眠潜伏期显著延长(P<0.01),睡眠持续时间显著缩短(P<0.01);在水迷宫实验中,模型组大鼠寻台时间延长(P<0.01);巴恩斯迷宫实验中,模型组大鼠测试探索期的目标洞口停留总时间显著缩短(P<0.01);避暗实验中,模型组错误次数增多(P<0.05),且潜伏期显著延长(P<0.01);高架十字迷宫实验中,模型组大鼠开臂停留时间显著缩短(P<0.01);旷场实验显示模型组大鼠在中央区域的停留时间、直立次数和运动总距离均低于空白组,其中中央区域的停留时间具有显著差异(P<0.01).结论 PCPA失眠模型具有较高的可重复性和稳定性,可以作为睡眠和记忆相关研究的基础模型.

目的 基于cAMP/PKA/CREB通路探讨柴胡皂苷A对失眠大鼠的改善作用及机制.方法 将 75 只SD大鼠随机分为空白组、模型组、柴胡皂苷A低剂量组(0.625 mg·kg-1)、柴胡皂苷A高剂量组(2.500 mg·kg-1)、艾司唑仑组(0.1 mg·kg-1),每组 15 只.采用腹腔注射苯丙氨酸(PCPA,0.1 mg·kg-1)复制失眠大鼠模型.观察大鼠一般情况及昼夜节律;采用戊巴比妥钠翻正实验测定大鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间;观测大鼠睡眠时相,记录慢波睡眠第 1 期(SWS1)、慢波睡眠第 2 期(SWS2)、快速眼球运动睡眠期(REMS)时长以及总睡眠时长(TST);qRT-PCR法测定下丘脑节律基因Clock、Bmal1 mRNA及钟控基因Rev-erbα、Rorα mRNA的表达水平;免疫荧光法测定海马组织NeuN表达水平;ELISA法测定脑组织中的cAMP水平;Western Blot法测定脑组织中Clock、Bmal1、Rev-erbα、Rorα及cAMP/PKA/CREB通路相关蛋白表达水平.结果 与空白组比较,模型组大鼠昼伏夜出的节律紊乱,极度兴奋,易激惹,睡眠减少;睡眠潜伏期明显延长(P＜0.05),睡眠持续时间及SWS1、SWS2、REMS、TST均明显缩短(P＜0.05);神经元排列紊乱,NeuN阳性神经元IOD值明显降低(P＜0.05);脑组织 Clock、Bmal1、Rev-erbα、Rorα mRNA 及蛋白表达水平明显降低(P＜0.05);脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).与模型组比较,给药组大鼠的攻击性明显减弱,昼伏夜出有节律性,活动减少,睡眠增多;睡眠潜伏期明显缩短(P＜0.05),睡眠持续时间及SWS1、SWS2、REMS、TST均明显延长(P＜0.05);神经元排列紊乱情况有所恢复,NeuN阳性神经元IOD值明显升高(P＜0.05);脑组织Clock、Bmal1、Rev-erbα、Rorα mRNA及蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);脑组织cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平明显升高(P＜0.05).结论 柴胡皂苷A可能通过激活cAMP/PKA/CREB通路改善失眠大鼠的昼夜节律.

目的 基于TLR4/NF-κB/MLCK通路研究百合地黄汤对对氯苯丙氨酸(PCPA)及多因素刺激所致失眠伴肠道菌群失调小鼠的治疗作用及机制,为临床用药提供理论依据.方法 将 84 只KM小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药物组(地西泮,1.38 mg·kg-1)、百合组(2.25 g·kg-1)、地黄组(2.25 g·kg-1)、百合地黄汤组(4.5 g·kg-1).采用夹尾 2 min、昼夜颠倒 24 h、垫料潮湿 24 h、45°鼠笼倾斜 24 h、交替鼠笼 24 h、禁食不禁水 24 h、冷水浴 3 min等多因素刺激 4 周结合PCPA腹腔注射 2 d共同制备失眠小鼠模型.模型复制成功后,给予相应的药物治疗.采用高架十字迷宫系统观察小鼠的焦虑样行为;通过翻正反射实验观察睡眠潜伏期和睡眠持续时间;16sRNA测序法分析小鼠肠道菌群组成结构;液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测脑和结肠γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、5-羟色氨酸(5-HTP)、5-羟色胺(5-HT)的浓度变化;免疫组织化学法检测结肠中闭锁小带蛋白 1(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)的表达情况;实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测结肠组织中基因白细胞介素 1β(IL-1β)、白细胞介素 6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、ZO-1、Occludin、Toll样受体 4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测结肠上皮组织中蛋白TLR4、NF-κB、磷酸化-核因子κB(p-NF-κB)、MLCK、肌球蛋白轻链(MLC)和磷酸化-肌球蛋白轻链(p-MLC)表达情况.结果 与正常组小鼠比较,模型组小鼠在高架十字迷宫中进入开臂区域的距离、在开臂区域停留的时间明显缩短(P＜0.05);睡眠潜伏期明显延长、睡眠持续时间明显缩短(P＜0.05);肠道菌群的丰富度、均匀度降低(P＜0.01);脑内神经递质GABA、Trp、5-HTP、5-HT浓度明显降低(P＜0.01),Glu浓度明显升高(P＜0.01);结肠中GABA、Glu浓度明显降低(P＜0.01),Trp、5-HTP、5-HT浓度明显升高(P＜0.01);结肠组织炎性因子 IL-1β、IL-6 以及 TNF-α基因表达水平明显升高(P＜0.01),ZO-1、Occludin基因和蛋白表达水平明显降低(P＜0.01),通路中TLR4、NF-κB、MLCK基因表达水平明显升高(P＜0.01),TLR4、p-NF-κB、MLCK、p-MLC蛋白表达水平明显升高(P＜0.01).与模型组小鼠比较,百合地黄汤能够明显延长失眠小鼠在高架十字迷宫中进入开臂区域距离、在开臂区域停留的时间(P＜0.05);明显缩短睡眠潜伏期、增加睡眠持续时间(P＜0.05);肠道菌群的丰富度、均匀度升高(P＜0.01);升高脑内神经递质GABA、Trp、5-HTP、5-HT浓度(P＜0.05,P＜0.01),降低Glu浓度(P＜0.01);升高结肠中GABA、Glu浓度(P＜0.01),降低Trp、5-HTP、5-HT浓度(P＜0.05,P＜0.01);下调IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达水平(P＜0.01),上调ZO-1、Occludin基因和蛋白表达水平(P＜0.01),下调通路中TLR4、NF-κB、MLCK基因表达水平和TLR4、p-NF-κB、MLCK、p-MLC蛋白表达水平(P＜0.01).结论 百合地黄汤能够有效治疗失眠伴肠道菌群失调症状,其作用机制可能与调节脑和肠内神经递质紊乱、下调TLR4/NF-κB/MLCK信号通路表达、上调紧密连接蛋白表达、降低炎症反应,进而修复肠黏膜机械屏障有关.

目的:研究枢机安神汤对氯苯丙氨酸(PCPA)失眠大鼠神经递质和焦虑的影响.方法:将大鼠分为对照组、模型组、中药低剂量组(8.5 g/kg)、中药中剂量组(13 g/kg)、中药高剂量组(17 g/kg)以及西药组(0.26 mg/kg),在建模后各组大鼠连续给药7 d,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察大鼠海马组织病理改变,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠海马组织中5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和血清中褪黑素(MT)的含量,蛋白质印迹法(Western Blotting)检测大鼠海马组织中乙酰胆碱酯酶(AChE)、脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白表达含量.结果:成功建立大鼠失眠模型,枢机安神汤能够提高大鼠体质量和睡眠时间,增加大鼠海马CA1区锥体细胞数量,增加海马组织中5-HIAA、5-HT、AChE、BDNF与血清中MT的含量,抑制海马组织中NE、DA含量.结论:枢机安神汤可改善PCPA失眠大鼠神经递质和焦虑状态,其机制与增加5-HT含量有关.另外,枢机安神汤还通过激活前额叶突触可塑性标志蛋白BDNF的表达,改善PCPA失眠大鼠的学习记忆能力.

[目的]观察加味半夏秫米汤对对氯苯丙氨酸(PCPA)诱导的失眠模型大鼠的治疗作用及机制.[方法]将48只雄性SD大鼠随机分成6组,即正常组,模型组,中药低、中、高剂量组和地西泮组,每组8只.造模前连续7d,中药低、中、高剂量组大鼠分别给予加味半夏秫米汤进行预防性治疗.除正常组外,其余各组大鼠均构建PCPA诱导失眠模型.第1天造模后,各组继续对应给药,连续7d.监测体质量,进行旷场试验行为学检测,采用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测血清中食欲素A(OXA)和食欲素B(OXB)含量,免疫组织化学法检测下丘脑食欲素受体1(OX1R)的表达,苏木素-伊红(HE)染色法观察大鼠下丘脑的病理变化.[结果](1)造模前各组大鼠体质量增长趋势平稳,组间无明显差异;造模后除正常组外,其余各组大鼠体质量增长速度减缓甚至下降;给予加味半夏秫米汤14d后,与模型组比较,中药中剂量组大鼠体质量上升显著(P＜0.01).(2)与正常组比较,模型组大鼠在旷场中活动总距离、中央区域的活动距离及进入中央区域的次数增加(P＜0.01),血清OXA和OXB含量显著升高(P＜0.01),下丘脑OX1R的表达显著升高(P＜0.01),HE染色显示下丘脑胶质细胞轻度增生;与模型组比较,中药中剂量组和地西泮组大鼠在旷场中活动总距离、中央区域的活动距离及进入中央区域的次数减少(P＜0.01),血清OXA和OXB含量显著降低(P＜0.01),下丘脑OX1R的表达显著降低(P＜0.01),HE染色显示大量神经元周围间隙增大,局部胶质细胞轻度增生.[结论]加味半夏秫米汤可通过下调血清中OXA和OXB的含量及下丘脑中OX1R的表达来改善大鼠失眠,减轻大鼠焦虑状态.

目的 研究紫河车冻干粉改善睡眠的作用及机制.方法 利用ip氯苯丙氨酸(PCPA)法制备大鼠失眠模型,设置对照组、模型组和紫河车冻干粉低、中、高剂量(0.09、0.18、0.36g·kg-1)组,每天ig给药1次,连续给药7d,对照组和模型组ig等量去离子水.通过检测体质量增长量、一般观察、翻正实验、旷场实验、强迫游泳实验、悬尾实验评价紫河车冻干粉改善睡眠的作用;利用Western blotting技术检测γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)、谷氨酸脱羧酶-65(GAD65)、γ-氨基丁酸转运体1(GATl)蛋白的表达水平.结果 与模型组比较,紫河车冻干粉低、中、高剂量组大鼠体质量增加量显著升高(P＜0.01);中、高剂量紫河车冻干粉具有显著缩短睡眠潜伏期(P＜0.05)、显著延长睡眠时间(P＜0.01)的作用;高剂量紫河车冻干粉使大鼠中央格停留时间显著延长(P＜0.01)、中央格穿格次数显著增多(P＜0.05)、站立次数和修饰次数显著增多(P＜0.01),说明高剂量紫河车冻干粉能够减轻失眠大鼠焦虑情绪,增强自发探索活动能力;高剂量紫河车冻干粉使大鼠漂浮时间缩短(P＜0.05),挣扎时间延长(P＜0.01),说明高剂量紫河车冻干粉能够减轻失眠大鼠的抑郁状态.Western blotting结果显示,与模型组相比,紫河车冻干粉处理组大鼠下丘脑组织中GABA-T的表达水平显著降低(P＜0.05),GAD65、GAT-1的表达水平显著升高(P＜0.05、0.01).结论 紫河车冻干粉可能通过调控GABA-T、GAD65、GAT-1蛋白的表达水平,发挥改善睡眠的作用.