[目的]植物线粒体基因变异是产生细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)的主要原因,利用生物技术是创造CMS不育系的重要手段.通过比较启动子、线粒体转运信号肽(mitochondrial targeting signal peptides,MTS)的不同组合对下游eGFP的表达强弱,来探究最佳马铃薯线粒体靶向表达载体.[方法]选择 3 个启动子AtUBI10、StUBI10、2×35S和两个线粒体转运信号肽ATPγ与Rf1b进行试验,利用烟草叶片瞬时表达系统和PEG介导马铃薯原生质体转化体系进行靶向载体的表达验证.[结果]六个线粒体靶向表达载体中AtUBI10::ATPγ-eGFP在烟草瞬时表达效果最佳,可准确定位到线粒体,其次为StUBI10::ATPγ-eGFP和 2×35S::ATPγ-eGFP;在马铃薯原生质体中载体AtUBI10::ATPγ-eGFP有最佳的表达效果,与烟草中表达结果一致,其次是StUBI10::Rf1b-eGFP和AtUBI10::Rf1b-eGFP,而 2×35S启动子的两个载体在原生质体均表达较弱.[结论]启动子AtUBI10 与线粒体转运信号肽ATPγ所构建的靶向线粒体载体为最佳组合,可用于马铃薯线粒体基因的相关研究中.

Cas蛋白作为核酸酶发挥其切割活性需要识别特定的PAM序列,如SpCas9 识别NGG PAM位点,LbCas12a识别TTTV PAM.已挖掘到新的能够识别TTCN PAM序列的蛋白—CasX蛋白,扩展了基因组编辑技术的编辑范围.本研究利用CasX的两个衍生型蛋白PlmCasX和DpbCasX,建立基于CRISPR/CasX介导的水稻基因编辑系统.通过PEG介导的水稻原生质体瞬时表达分析其编辑活性发现,PlmCasX和DpbCasX两个蛋白能够对水稻内源基因OsCPK16 实现有效编辑.后通过水稻稳定遗传转化进一步验证,在TTCA PAM识别位点,DpbCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21 的编辑效率为 17.5%,PlmCasX蛋白对水稻内源基因OsCPK21 的编辑效率为 66.07%;在TTCG PAM识别位点,PlmCasX蛋白对OsCPK4 的编辑效率为 23.21%,而DpbCasX蛋白不能实现有效的基因编辑.并且基于MIDAS方法对PlmCasX蛋白的优化并不能提高其编辑活性.本研究证明了CRISPR/CasX系统在水稻中具有编辑活性,且其能识别TTCR PAM这一特性,扩大了基因编辑技术在水稻中的应用范围.

为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察.用PEG介导的瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中.结果表明,以雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是酶液配比为2.0％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.5％离析酶,甘露醇浓度为0,6 mol.L-1,酶解10小时,处理转速为67×g;用PEG介导法将含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光.通过实验筛选得到雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定了基础.

以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因(hph)为筛选标记,应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究.潮霉素敏感性测试结果表明,黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/L.PEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为:30℃下用2％裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h,过滤收集原生质体,经MTC清洗重悬后将质粒pYF11-hph转化黑附球菌原生质体,在RM培养基中混匀再生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证,表明外源基因hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达.本实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系,为研究其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障.

[目的]研究表明,细胞色素P450 (CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关.论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据.[方法]通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southem blotting验证得到单拷贝敲除突变体.将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体.最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用qRT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平.[结果]通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体.与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3％.qRT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低.重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5％.互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平.[结论]Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关.

Helitron是一种广泛存在于真核生物中的可移动遗传元件.与其他转座子不同,自主Helitron元件可编码具有复制引发(Rep)和解旋酶(Hel)结构域的转座酶,并通过滚环复制的方式在基因组中进行扩张.本研究对9种尖孢镰刀菌中的自主Helitron元件进行系统分析,结果表明尖孢镰刀菌中存在两类自主Helitron元件FoHeli1与FoHeli2.其中FoHeli1成员间序列高度相似,并具有明晰的边界特征:3’端为保守的“TATTTT”序列,其上游可形成稳定的发夹结构,且发夹上游可与5’端形成12bp的反向互补结构.基于上述分析结果,从尖孢镰刀菌Fo4287菌株中克隆获得完整的FoHeli1元件,并通过构建双元转座系统及PEG介导的原生质体转化,证明尖孢镰刀菌中的FoHeli元件可在禾谷镰刀菌PH-1菌株的基因组中发生跳转.

以沙冬青 (Ammopiptanthus mongolicus (Maxim.ex Kom.) Cheng f.) 幼苗的子叶为材料, 对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究.结果表明, 子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0％纤维素酶R-10+0.5％离析酶R-10+0.3％半纤维素酶+9.0％甘露醇 (p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h.采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤, 将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min, 所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g, 活力达到90％;以纯化的原生质体作为受体, 利用聚乙二醇 (PEG) 介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中, 转化效率达到50.8％.利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系, 检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内.

NAC转录因子在植物信号转导及非生物损伤过程中起重要作用.本实验从烟草cDNA文库中克隆了Nt-基因,cDNA编码区全长861 bp,编码286个氨基酸.进化树分析结果显示,NtNACI基因编码的氨基酸序列与马铃薯同源性最高.农杆菌介导的遗传转化获得37株转基因烟草,用20％ PEG6000处理转基因和野生型植株7d.结果显示,转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的酶活性都高于野生型,丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)含量都低于野生型.RT-PCR分析结果显示,NtNACI基因以;基因表达高于野生型,脯氨酸合成的2个关键酶吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸-δ-氨基转移酶(δ-OAT)基因表达低于野生型.选取T0代转基因和野生型种子,对苗期根系进行耐旱性分析.结果发现,在300 mmol·L-1甘露醇胁迫下,转基因根系比野生型长,野生型根系的生长明显受到抑制.这表明转NtNACI基因的表达可能提高了植株的抗旱能力.

[目的]分析辣椒疫霉中RXLR型效应子PcAvh2的序列多态性,研究该效应子在辣椒疫霉生长发育和侵染阶段的转录特征及其生物学功能.[方法]本研究通过高保真扩增,分析2个烟草疫霉、1个恶疫霉和31个辣椒疫霉菌株的PcAvh2序列;提取辣椒疫霉菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发休止孢和7个侵染时间点(1.5、3、6、12、24、36、72 h)的本氏烟根部总RNA,利用RT-qPCR分析PcAvh2的转录表达水平;利用PVX瞬时表达系统,分析PcAvh2是否抑制6种效应子(BAX、INF1、PsojNIP、PsCRN63、PsAvh241、R3a/Avr3a)激发的植物免疫反应;利用CaCl2-PEG介导的原生质体稳定转化技术,沉默PcAvh2基因,分析辣椒疫霉致病力的变化.[结果]PcAvh2为典型的RXLR效应子,在辣椒疫霉群体中该效应子具有10个等位基因,而且烟草疫霉和恶疫霉中也存在该效应子.该基因在辣椒疫霉的侵染阶段上调表达,它能够抑制6种效应子激发的植物免疫反应,进一步研究发现基因沉默导致辣椒疫霉的致病力显著下降.[结论]RXLR型效应子PcAvh2是辣椒疫霉中一个重要的侵染致病因子.

粉红聚端孢是多种植物的重要病原菌.本研究通过酶解粉红聚端孢幼嫩菌丝细胞壁获得原生质体,用PEG介导原生质体转化将携带GFP基因和博来霉素抗性基因的外源DNA随机插入粉红聚端孢基因组,共获得博来霉素抗性菌株90株,转化效率达18个/μg.选取22株转化子荧光观察,发现均可表达荧光,菌株间荧光强度不同,其中10株转化子荧光表达较强.与野生型相比,突变菌株TR45的菌落生长、产孢量和致病力等生物学特性均未改变,在不含博来霉素的培养皿中继代培养10代荧光仍能稳定表达.本研究构建的高效原生质体制备和PEG介导粉红聚端孢遗传转化方法,可用于该菌基因功能研究,绿色荧光标记菌株可用于病菌侵入、田间监测、侵染循环等发生规律研究.