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真核细胞延长因子2基因RNA干扰慢病毒质粒的构建及验证
编辑人员丨4天前
目的 构建真核细胞延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,为后续研究eEF2在乳腺癌细胞发生发展中的作用提供实验依据.方法 根据eEF2的基因序列和短发夹RNA序列的设计原则设计合成3对shRNA序列,将shRNA序列复性后插入慢病毒载体LV-U6-shR-NA-ZSgreen-Puro,构建3种不同eEF2基因敲低靶点的重组质粒sh1、sh2、sh3,以空载体作为阴性对照组(shNC).采用慢病毒三质粒包装系统共分别转染人肾上皮细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增.经酶切及测序验证正确后,将重组慢病毒感染对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7,72h后荧光显微镜观察绿色荧光强度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测eEF2 mRNA转录水平,Western blot法检测eEF2蛋白表达水平.结果 eEF2 shRNA载体测序与原设计序列完全一致.重组慢病毒感染的MCF-7中可见绿色荧光蛋白表达.与shNC组相比,eEF2敲低的sh2和sh3组MCF-7细胞中eEF2 mRNA的转录水平明显降低(t分别为9.244和5.938,P分别为0.001和0.004);sh1、sh2和sh3组细胞中eEF2蛋白的表达水平均明显降低(t分别为3.552、9.614和4.432,P分别为0.024、0.001和0.011).结论 成功构建了eEF2基因低表达的慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,有望为临床乳腺癌的治疗提供基于翻译靶向治疗的新靶点.
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编辑人员丨4天前
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初步构建与评估递送柚皮素的RGD外泌体
编辑人员丨4天前
目的:本研究旨在制备生物合成纳米载体递送柚皮素(naringenin,Ng),并研究其对乳腺癌的体外抑瘤效果.方法:使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-前列腺素F2受体阴性调节因子-绿色荧光蛋白(Arg-Gly-Asp-prostaglandin F2 receptor negative regulator-green fluorescent protein,RGD-P-G)质粒进行转染,构建分泌 RGD-P-G 外泌体(RGD-P-G-Exosomes,RGD-P-G-Exo)的293F细胞.通过超速离心收集293F细胞上清液中的RGD-P-G-Exo,加入Ng,并通过水浴超声促使RGD-P-G-Exo包封Ng,形成RGD-P-G-Exo@Ng.使用荧光显微镜对转染RGD-P-G的293F细胞进行鉴定.通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术、蛋白质免疫印迹等方法对RGD-P-G-Exo@Ng的形貌、粒径、标志物和绿色荧光蛋白(GFP)表达情况进行表征.采用紫外分光光度法评估包封率和载药量.通过细胞摄取实验评估纳米药物被吞噬摄取的效果.通过CCK-8法检测Exo@Ng和RGD-P-G-Exo@Ng对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤能力.结果:电镜结果显示RGD-P-G-Exo@Ng呈茶托状结构,纳米颗粒追踪分析技术显示RGD-P-G-Exo@Ng粒径主要分布在147.0 nm.蛋白免疫印迹结果表明RGD-P-G-Exo@Ng表达CD9、CD63等外泌体标志物和GFP,证明RGD-P-G-Exo的构建成功.RGD-P-G-Exo@Ng纳米药物的包封率为(28.1±0.6)%,载药量为(6.0±0.1)%.在高浓度下,Exo及RGD-P-G-Exo对MDA-MB-231细胞的存活率无显著影响,具有良好的生物相容性.在细胞摄取实验中,与Exo@Ng相比,RGD-P-G-Exo@Ng具有更强的细胞摄取效果(P<0.05).药效实验中,Exo@Ng和RGD-P-G-Exo@Ng均表现出浓度依赖性的MDA-MB-231细胞毒性,其中RGD-P-G-Exo@Ng比相同浓度的Exo@Ng具有更强的细胞杀伤能力(P<0.05).结论:本研究初步合成了一种用于靶向递送Ng的纳米药物,为开发生物纳米靶向肿瘤药物递送系统提供了新的策略.
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编辑人员丨4天前
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溶质载体家族3成员2表达与双硫死亡、铁死亡及肿瘤关系的研究进展
编辑人员丨4天前
铁死亡和双硫死亡与多种疾病相关.铁死亡的特征是铁离子和脂质活性氧的异常累积,而双硫死亡则是二硫化物的异常累积.溶质载体家族3成员2(SLC3A2)作为溶质载体家族的一员,不仅参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡,还参与细胞铁死亡和双硫死亡,在肿瘤的发生发展中起关键作用.本文阐述了SLC3A2与双硫死亡、铁死亡和肿瘤关系的研究进展,旨在为癌症靶向治疗提供理论基础.
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编辑人员丨4天前
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早老蛋白增强子2基因沉默对HaCaT细胞增殖及γ分泌酶表达的影响
编辑人员丨4天前
目的:构建早老蛋白增强子2(PSENEN)基因沉默的人永生化角质形成细胞(HaCaT)模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染:shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR(qPCR)、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白(NCT)、早老蛋白1(PS1)、前咽缺陷蛋白1a(APH1a)mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组(1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075)相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA(0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009)、蛋白(0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062)表达均显著降低(均 P < 0.001)。CCK8法显示,与NC组相比,shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高(均 P < 0.05),24和60 h差异无统计学意义(均 P > 0.05);shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组(均 P < 0.05)。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义( F值分别为8.168、4.644、1.981,均 P > 0.05),mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义( F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均 P ≤ 0.01)。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低(均 P < 0.01),imNCT蛋白表达变化无统计学意义(均 P > 0.05)。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。
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编辑人员丨4天前
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靶向甲型流感病毒血凝素蛋白的广谱抗体制备及鉴定
编辑人员丨4天前
目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白的广谱抗体FHA3,并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合,且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性,在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞,在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。
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编辑人员丨4天前
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靶向沉默高迁移率族蛋白N2表达对肾癌细胞的侵袭和凋亡的影响
编辑人员丨4天前
目的:探究shRNA-高迁移率族蛋白N2(HMGN2)慢病毒载体对肾癌细胞侵袭能力和凋亡水平的影响,并研究其作用机制。方法:选择2017年1月至2018年12月天津市第四中心医院收治的31例肾细胞癌患者,术中收集患者的肿瘤组织和瘤旁组织。利用免疫组织化学染色,采用RT-qPCR和Western blot等方法检测shRNA-HMGN2的表达以及凋亡分子标志物Caspase-3和Caspase-9的表达,利用shRNA干扰技术构建shRNA-HMGN2慢病毒载体,利用人肾癌细胞系ACHN和A498细胞作为体外实验的对象,根据有无转染shRNA-HMGN2质粒,将细胞分成三组,即A组细胞未做任何处理,B组细胞经空白载体慢病毒转染,C组细胞经shRNA-HMGN2载体构建的慢病毒转染。Transwell试剂盒检测三组细胞的侵袭能力和凋亡水平。结果:肿瘤组织的HMGN2蛋白的表达量要明显高于瘤旁组织( P<0.05)。在人肾癌细胞系ACHN细胞和A498细胞中,C组的细胞侵袭能力要低于A组和B组( P<0.05),C组的细胞凋亡水平要高于A组和B组( P<0.05)。另外,人肾癌ACHN细胞和A498细胞中,C组HMGN2的mRNA相对表达量和蛋白表达量要低于A组和B组( P<0.05),而C组Caspase-9和Caspase-3的mRNA相对表达量和蛋白表达量要高于A组和B组( P<0.05)。 结论:shRNA-HMGN2慢病毒载体可以抑制肾细胞癌的侵袭,促进肾细胞癌的凋亡,可以作为潜在的治疗靶点。
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编辑人员丨4天前
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靶向EGFR可见光量子点用于三阴乳腺癌显像的实验研究
编辑人员丨4天前
目的:探索可见光量子点(QDs)作为载体靶向表皮生长因子受体(EGFR)用于三阴乳腺癌体外和在体靶向显像的可行性。方法:水溶性QDs与西妥昔单克隆抗体(Cetuximab)反应合成探针QD-Cetuximab,检测其形态、粒径、稳定性和发光特性。培养人乳腺癌细胞MDA-MB-468(EGFR+)和MDA-MB-453(EGFR-),与QD-Cetuximab和QDs温育进行细胞毒性实验、细胞显像和荧光定量分析。制备MDA-MB-468荷瘤裸鼠8只,经尾静脉注射100 μl QD-Cetuximab和QDs,观察不同时间点的显像结果和探针分布。采用两独立样本 t检验分析数据。 结果:电镜下QD-Cetuximab粒径为(40.34±2.44) nm,动态光散射(DLS)结果示其水合粒径为(57.85±4.69) nm,且结构稳定。QD-Cetuximab浓度≤50 nmol/L时,细胞相对存活率>90%;而当浓度增至100 nmol/L,细胞相对存活率降至(72.52±4.91)%。MDA-MB-468经QD-Cetuximab温育后发出的红色荧光比MDA-MB-468用QDs温育和MDA-MB-453用QD-Cetuximab、QDs温育的均强,标准化后的荧光强度定量分析显示QD-Cetuximab组荧光强度是QDs组的5.1倍(863.36/169.97)。流式细胞分析示MDA-MB-468摄取QD-Cetuximab和QDs均随其浓度增加而增加,但前者明显高于后者( t值:12.25~38.11,均 P<0.05),25、50、100和200 nmol/L浓度下QD-Cetuximab组的平均荧光强度与QDs组的比值分别为5.4、6.9、7.4和6.2。QD-Cetuximab和QDs探针在体内都主要聚集在肝,在肝发出荧光的背景下肿瘤发出的荧光不明显,但离体瘤组织可见荧光,QD-Cetuximab组和QDs组的离体瘤组织荧光强度分别为(2.46±0.60)×10 4和(1.29±0.05)×10 4( t=3.392, P=0.015)。 结论:偶联Cetuximab的QDs增加了对表达EGFR的三阴乳腺癌细胞的靶向能力;QD-Cetuximab在三阴乳腺癌裸鼠离体成像效果尚可,但需进一步修饰,减少肝摄取。
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编辑人员丨4天前
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LncRNA Gm13568调控A1型星形胶质细胞活化及在EAE小鼠病变中的作用
编辑人员丨4天前
目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)Gm13568对A1型星形胶质细胞活化及实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠疾病进程的影响与分子机制。方法:构建特异性靶向星形胶质细胞的lncRNA Gm13568沉默与对照的重组慢病毒载体,分别命名为LV-Inhibit-Gm13568和LV-ctrl,并包装病毒。1×10 7 TU病毒悬液静脉注射入C57BL/6小鼠体内7 d后,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG 35-55)多肽诱导EAE模型。实验分为PBS组、EAE组、LV-ctrl+EAE组和LV-Inhibit-Gm13568+EAE组,采用双盲法每日对小鼠进行神经功能评分。EAE小鼠诱导后23 d,取各组小鼠脊髓组织,利用real-time PCR测定A1型星形胶质细胞活化指标Serping 1、C3、Srgn和H2-T23的mRNA转录水平,同时测定IL-6、TNF-α、巨噬细胞趋化蛋白-1(macrophage chemotactic protein-1, MCP-1)和干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10, IP-10)的生成变化;Western blot检测脊髓组织胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和Notch1的表达及信号转导与转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的磷酸化水平(phosphorylated STAT3, p-STAT3);免疫荧光法检测各组脊髓组织中Notch1活化后的胞内段蛋白(Notch1 intracellular domain,NICD)与GFAP的共表达;HE和劳克坚牢蓝染色(Luxol fast blue,LFB)分别观察脊髓组织内炎症细胞浸润及髓鞘脱失变化。 结果:与PBS组比较,EAE组和LV-ctrl+EAE组小鼠A1型星形胶质细胞活化增生,Notch1的表达显著上调。沉默内源性lncRNA Gm13568后,与LV-ctrl+EAE组比较,小鼠的神经功能评分在抗原诱导后23 d从平均3.5分下降至1分以下,临床症状缓解,A1型星形胶质细胞活化降低,同时炎性因子及趋化因子生成减少;Notch1、GFAP、NICD的蛋白质表达水平和STAT3的磷酸化水平显著降低;小鼠脊髓组织炎性细胞浸润与髓鞘脱失显著减轻。结论:LncRNA Gm13568可能通过调控Notch1/STAT3信号调控A1型星形胶质细胞的活化,从而调节炎性因子及趋化因子的产生,参与EAE的病变进程。
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编辑人员丨4天前
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Lnc CPS1-IT1靶向调控内皮-间质转化抑制OSA所致肺动脉高压的机制
编辑人员丨4天前
目的:探讨在低氧环境下,长链非编码RNA CPS1内含子转录本1(Lnc CPS1-IT1)通过影响内皮-间质转化(EndoMT)治疗阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)所致肺动脉高压(PH)的分子调控机制。方法:本研究为实验研究。以人脐静脉内皮细胞构建OSA的细胞模型,并使用该模型分别构建空白对照组,空过表达载体组(阴性对照过表达载体),长链非编码RNA CPS1内含子转录本1(Lnc CPS1-IT1)过表达组(Lnc CPS1-IT1过表达载体),空沉默载体组(阴性对照沉默载体),沉默Lnc CPS1-IT1组(沉默Lnc CPS1-IT1的短发夹RNA);使用吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC)阻断细胞核因子κB(NF-κB)信号通路构建Lnc CPS1-IT1过表达+PDTC组。比较空过表达载体组与Lnc CPS1-IT1过表达组,空沉默载体组与沉默Lnc CPS1-IT1组EndoMT相关分子标志物[血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、锌指转录因子(SNAIL)]和胶原蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原)mRNA、蛋白表达,以及促炎细胞因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10、IL-13]的水平。通过Transwell测定法检测Lnc CPS1-IT1对于细胞迁移能力的影响。RNA免疫沉淀和荧光素酶报告基因法检测Lnc CPS1-IT1和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的结合情况。比较PDTC处理前后EndoMT相关分子标志物和胶原蛋白mRNA、蛋白表达,以及促炎细胞因子的水平。结果:Lnc CPS1-IT1过表达组CD31 mRNA和蛋白表达均较空过表达载体组升高,α-SMA、SNAIL、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达均较空过表达载体组降低,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。沉默Lnc CPS1-IT1组中CD31 mRNA和蛋白表达均较空沉默载体组降低,α-SMA、SNAIL、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达均较空沉默载体组升高,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。Lnc CPS1-IT1过表达组TNF-α、IL-10、IL-13的水平均较空白过表达载体组降低,沉默Lnc CPS1-IT1组TNF-α、IL-10、IL-13的水平均较空白沉默载体组升高,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。与空白对照组(49.33±2.52)相比,Lnc CPS1-IT1过表达组细胞迁移数量减少(30.00±2.65),而沉默Lnc CPS1-IT1组细胞迁移数量增多(82.00±4.00),差异均有统计学意义(均 P<0.001)。RNA免疫沉淀结果显示,Lnc CPS1-IT1与HIF-1α的结合较免疫球蛋白G增加,差异有统计学意义[(4.22±0.03)比(0.99±0.02), t=163.50, P<0.001]。荧光素酶报告基因法检测结果显示,Lnc CPS1-IT1与HIF-1α结合后的荧光强度下降[(120.33±2.83)比(24.33±2.12)],差异有统计学意义( t=43.42, P<0.001)。Lnc CPS1-IT1过表达+PDTC组CD31 mRNA和蛋白质较Lnc CPS1-IT1过表达组升高,α-SMA、SNAIL、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白质均较Lnc CPS1-IT1过表达组降低,差异均有统计学意义(均 P<0.001)。Lnc CPS1-IT1过表达+PDTC组TNF-α、IL-10、IL-13水平均较Lnc CPS1-IT1过表达组下降(均 P<0.05)。 结论:Lnc CPS1-IT1可以通过抑制HIF-1α的转录活性影响NF-κB通路,降低炎症因子的释放,靶向调控EndoMT,从而抑制OSA所致PH。
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编辑人员丨4天前
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靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶抗体的制备及鉴定
编辑人员丨4天前
目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的功能性抗体FNA1,并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)序列信息,合成FNA1重链以及轻链可变区序列,连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ,构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合,流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原,且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白,有效阻断细胞膜表面的NA活性,从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放,继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。
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编辑人员丨4天前
