为优化巨大侧耳原生质体的制备条件,该研究以两株不同温型的巨大侧耳菌株PG46 和PG79 为材料,采用单因素和正交试验方法对原生质体制备的菌丝体菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶浓度、酶解温度和酶解时间进行研究.结果表明:(1)在单因素实验中,巨大侧耳原生质体制备的适宜条件为菌龄5d,溶壁酶浓度2.5%,0.6 mol?L-1甘露醇,32℃(PG46)或 27～35℃(PG79)酶解 4 h.(2)正交试验验证并优化了单因素实验结果,组合 2(菌龄 5d,溶壁酶浓度 2.5%,0.6 mol?L-1的甘露醇,32℃酶解 4h)可同时作为PG46 和PG79 原生质体制备的最适条件,原生质体产量分别为 11.22×106 CFU?mL-1和 7.28×106 CFU?mL-1.(3)F-test检验中,各因素对原生质体制备的影响程度依次为菌龄>溶壁酶浓度>酶解温度>酶解时间(PG46),菌龄>酶解时间>酶解温度>溶壁酶浓度(PG79).综上所述,两株不同温型巨大侧耳菌株的原生质体制备条件基本一致,菌龄对两菌株原生质体得率的影响程度最显著.该研究结果可为后续巨大侧耳的杂交育种、遗传转化、全基因组测序等工作奠定基础,进一步推动巨大侧耳分子遗传学的发展.

为探索药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii)悬浮细胞原生质体提取的最优条件,并建立雷公藤原生质体瞬时转化体系,以雷公藤悬浮细胞为材料,对酶解液配比、酶解时间、甘露醇浓度及处理转速进行考察.用PEG介导的瞬时转化法将外源基因转化到雷公藤原生质体中.结果表明,以雷公藤悬浮细胞为材料提取原生质体的最佳条件是酶液配比为2.0％纤维素酶+0.5％果胶酶+0.5％离析酶,甘露醇浓度为0,6 mol.L-1,酶解10小时,处理转速为67×g;用PEG介导法将含有编码GFP的植物表达载体转化雷公藤悬浮细胞原生质体,激光共聚焦扫描显微镜下细胞显示绿色荧光.通过实验筛选得到雷公藤悬浮细胞原生质体的最佳提取条件,建立了雷公藤悬浮细胞原生质体的瞬时转化体系,为进一步开展雷公藤功能基因及合成生物学研究奠定了基础.

为明确致病疫霉的致病机理需要建立高效的病原菌原生质体制备和再生体系.通过对马铃薯晚疫病菌制备和再生过程的研究,采用两种裂解酶Driselase和Cellulase R-10,以不同菌龄、裂解酶、裂解酶的浓度和裂解酶的反应时间为研究条件,得到原生质体制备的最佳条件为:以培养18 d的菌丝体为材料,用10 mg/mL Driselase处理菌丝60 min后,原生质体产量达9.5×104个/g;以0.1 mol/L氯化钙和0.4 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,以黑麦V8固体再生培养基得到的原生质体再生率最高达3.1％.

以秀珍菇单核菌丝为材料,用溶壁酶进行原生质体的制备,考察各因素对原生质体产量的影响,用单因素试验和正交试验确定最佳条件.结果表明,菌龄为8 d菌丝体,0.6 mol/L甘露醇+10 mmol/L Tris-HCl为稳渗剂,酶解温度29℃、酶浓度1.6％的条件下酶解160 min.原生质体产量达到3.5×107 CFU/mL,原生质体再生率达到1.4％.

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平.方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S.viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究.结果 S.viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为:以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min.以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3％,其中,阿维拉霉素A占组分含量81％,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4％,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定.另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4％.结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力.

以珍稀食用菌花脸香蘑菌丝为原材料,对原生质体制备与再生条件进行系统研究,并通过响应面法优化酶解液种类、酶解温度、酶解时间和稳渗剂等影响因素.结果表明以0.6mol/mL甘露醇作稳渗剂,在以1％溶菌酶+1％蜗牛酶+1％纤维素酶为复合酶解液,酶解温度为30℃,60-70r/min摇床振荡培养条件下,酶解4h,原生质体产量达到2.31×107CFU/mL,在以蔗糖为稳渗剂的液体培养基上再生率达到25％.研究结果可为花脸香蘑后期研究提供依据.

原生质体融合技术是一种重要的微生物育种方法. 以能产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌ZGL14为出发菌株,探讨影响其原生质体制备和再生的主要因素. 通过研究菌龄、溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的pH值、再生培养基类型和培养方式等对枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备与再生的影响,确定其最优化条件. 结果显示:枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备的最优条件为菌龄9 h,溶菌酶浓度0.2 mg/mL,酶解时间10 min,酶解温度32 ℃,渗透压稳定剂的pH值7.0. 在此条件下,枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体的形成率为98％,再生率达30％. 枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体再生培养基以琥珀酸钠作为渗透压稳定剂并结合Ca2+再生效果较好,再生方式以单层培养较好. 本研究获得了枯草芽孢杆菌ZGL14原生质体制备和再生的最佳条件,可为实现其融合育种提供技术支持. (图7 表1 参14)

为建立大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)原生质体的制备和再生体系,采用单因素分析法分析了大丽轮枝茵摇培时间、裂解酶浓度、酶解时间和温度、渗透压稳定剂的种类和浓度及pH对原生质体释放的影响;从再生培养基、培养基Agar浓度和酶解时间对原生质体的再生条件进行了优化;并对优化条件下获得的原生质体进行了GFP瞬时表达.结果表明,将分生孢子培养18h收集菌丝体,以1.2 mol/L的KC1作为渗透压稳定剂,在pH 6.0的条件下,加入10 mg/mL的裂解酶,30℃酶解4h时,获得的原生质体产量最高,达到3.3×107个/mL;在Agar浓度为0.5％的TB3再生培养基中进行原生质体再生,再生率最高,可达22.45％;GFP瞬时表达结果表明,优化条件下获得的原生质体可用于遗传转化材料.

细菌载体是当前纳米载药系统研究的热点,其具有粒径小、靶向性能强、可装载化学药物和核酸药物的能力并且易于制备的特点.以活菌作为载体,容易引起生物体免疫反应,存在潜在的安全问题.通过基因工程技术和生物工程技术,可以获得低免疫原性和低毒性的细菌衍生物,并使其具有一定的靶向功能,能够用作载体来递送具有治疗作用的药物至肿瘤靶组织或靶细胞,这引起研究者的广泛关注.本文中,笔者选择3种常见的细菌衍生物——细菌外膜囊泡、细菌原生质体和微细胞这3种细菌衍生物载体在肿瘤治疗中的研究进展进行综述,以期为肿瘤治疗中药物递送系统的构建提供借鉴.

为建立高效稳定的广藿香原生质体培养与融合技术体系,该研究以广藿香愈伤组织悬浮细胞为材料,研究了原生质体制备的酶解条件和培养方法、细胞密度、激素种类和浓度等因素对原生质体培养的影响,并通过测定融合产物直径确立融合细胞筛选范围,进一步研究聚乙二醇浓度、细胞密度、融合时间及融合液加入量等因素对原生质体融合的影响.结果表明:制备原生质体的适宜条件为pH5.8,酶解温度25℃;原生质体培养以铵盐减半的MS1培养基进行海藻酸钠包埋、激素选用0.2 mg·L?1 NAA、2.0 mg·L?16?BA,培养密度2.0×105个·mL?1、蔗糖添加量1.0％、酸水解酪蛋白500 mg·L?1的条件下原生质体分裂频率、植板率均较高,且开始分裂时间和细胞团形成时间都较短;双细胞融合产物筛选范围为69.33～87.35μm;以40％PEG 6000化学促融30 min、加入0.5倍体积的融合液、细胞密度2.0×105个·mL?1的条件进行原生质体融合,聚合率可达57.19％;获得的融合产物经海藻酸钠包埋培育2个月后可观察到再生愈伤组织.