目的:利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法:设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果:本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。

目的 构建靶向B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6 co-repressor,BCOR)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并在HEK 293T细胞系中进行BCOR基因编辑,为研究BCOR的功能打下基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计两对靶向BCOR基因的单链引导RNA(small guide RNA,sgRNA),将PX458载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到PX458载体中,转化到宿主菌DH5α大肠埃希菌中.过夜后每个sgRNA-PX458质粒挑取3个阳性克隆,进行PCR和测序验证.挑选序列正确的BCOR sgRNA-PX458质粒,转染HEK 293T细胞,进行BCOR基因编辑,采用荧光显微镜及流式细胞学观察HEK 293T细胞绿色荧光蛋白表达的情况,确定是否成功及转染效率,提取HEK 293T细胞DNA,PCR扩增BCOR基因的相应片段,进一步Sanger测序验证,鉴定BCOR sgRNA-PX458 CRISPR/Cas9系统对BCOR基因的编辑能力和效率.结果 经测序验证,成功构建了靶向BCOR sgRNA-PX458质粒的CRISPR/Cas9系统,转染HEK 293T细胞后,可见HEK 293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,测序鉴定发现BCOR sgRNA-PX458质粒能够产生插入或者缺失,可以成功编辑BCOR基因.结论 成功构建了靶向BCOR的sgRNA-PX458质粒,可在HEK 293T上成功编辑BCOR基因,为进一步研究BCOR的功能奠定了基础.

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型.方法 针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变.结果 成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74％、12.36％、12.54％、2.94％.测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加.结论 本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础.

目的:建立BD FACSAria II流式细胞分选仪富集PX458空载质粒转染J774A.1细胞的方法并进行技术优化,确立用于筛选J774A.1细胞的最佳条件.方法:构建PX458空载质粒转染J774A.1细胞株,进行7-AAD染色.选择BD FACSAria II流式细胞分选仪的100μm喷嘴以及initial、4-way purity、purity、yield、fine tune、single cell 6种分选模式分选J774A.1细胞的GFP阳性转染株,比较仪器各部分参数变化对分选效率的影响.结果:在仪器稳定的液流条件下,100μm喷嘴各分选模式所得细胞纯度均达80％以上,其中purity模式分选效率最高,达95.7％±1.0％.结论:使用BD FACSAria II流式细胞分选仪100μm喷嘴分选PX458空载转染的J774A.1细胞选择purity分选模式最合适.

[目的]探讨脂质体介导基因编辑载体质粒转染人食管癌Eca-109细胞的最佳条件.[方法]以基于Cre/LoxP系统的pGT-A1B1和基于CRISPR/Cas9系统的pX458-sgRNA8两种基因编辑载体质粒为实验材料,将环状和线性质粒以不同DNA用量(0.2、0.4、0.6和0.8 μg)和不同DNA与脂质体比例(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶3)转染Eca-109细胞,计算转染效率.[结果]不同DNA用量条件下,pGT-A1B1在0.4μg和0.6 μg时转染效率较高,pX458-sgRNA8在0.6 μg时转染效率较高,与其它DNA用量比较均有显著性差异(P＜0.05).不同DNA与脂质体比例条件下,pGT-A1B1在比例为1∶1.5和1∶2时转染效率较高,pX458-sgRNA8在比例为1∶2.5时转染效率较高,与其它比例比较均有显著性差异(P＜0.05).同一种质粒的环状和线性结构形态,在DNA用量或DNA与脂质体比例相同时,转染效率差异不显著(P＞0.05).[结论]建立了脂质体介导基因编辑载体质粒转染Eca-109细胞的最佳转染条件,质粒pGT-A1B1和pX458-sgRNA8的DNA用量分别为0.4～0.6 μg和0.6 μg,DNA与脂质体比例分别为1∶1.5 ～1∶2和1∶2.5.

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒.设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功.将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况.测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功.其在293T细胞中的转染效率约为50％,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果.初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5.

目的 ezrin基因在胰腺癌中过表达,其上游序列对于基因表达具有重要作用.文章拟敲除胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区,鉴定其基因编辑gRNA靶位点.方法 将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区.使用在线软件预测ezrin转录调控区上下游gRNA靶位点,构建基因编辑重组质粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R.将重组质粒共转染Panc-1细胞,针对gRNA靶位点进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定ezrin转录调控区的靶向敲除.向转染重组质粒的Panc-1细胞中加入嘌呤霉素初步筛选,采用水溶性四氮唑盐法检测细胞增殖能力.结果 荧光素酶报告基因检测结果显示,Panc-1细胞中ezrin基因-1297/-1186片段对SV40启动子和ezrin启动子具有转录增强作用.亚克隆测序结果显示,携带ezrin转录调控区gRNA靶位点序列的重组质粒共转染至Panc-1细胞,细胞基因组DNA出现片段缺失,位于gRNA-L和gRNA-R靶位点之间.细胞增殖实验结果显示,转染重组质粒的Panc-1细胞,其增殖能力显著受到抑制.胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因-1297/-1186为转录调控区,其上游gRNA-L和下游gRNA-R序列可作为基因编辑靶点.结论 实现了ezrin转录调控区的靶向敲除,Panc-1细胞增殖能力的抑制有可能与ezrin转录调控区的敲除有关.

目的:探讨miR-10a抑制Tiam1表达对胃癌细胞凋亡和侵袭的影响.方法:获取胃上皮组织细胞及胃癌组织细胞,利用qPCR及Western blot实验检测两种细胞中miR-10a表达与Tiam1的mRNA及蛋白表达水平,同时检测胃癌细胞S746T及正常胃粘膜细胞RGM-1和NGEC中miR-10a表达与Tiam1蛋白表达水平.通过将miR-10amimic和miR-10a inhibitor转染HS746T细胞,利用流式细胞术检测HS746T的细胞周期和细胞凋亡,TranswellTM实验检测HS746T细胞的侵袭能力,qPCR及Westem blot实验检测凋亡相关蛋白caspase3、caspase9和Bax以及周期相关蛋白P21表达水平;荧光素酶活性分析实验检测Tiam1是miR-10a的作用靶点.已构建的Tiam1高表达的Tiam1-pcDNA3.1质粒和敲除Tiam1基因的PX458质粒分别转染HS746T细胞,通过流式细胞术及TranswellTM实验检测HS746T细胞的凋亡及侵袭能力.结果:与胃上皮组织细胞相比,早期胃癌临床组织细胞中miR-10a表达降低,Tiam1的mRNA及蛋白表达升高;miR-10a的表达与早期胃癌患者的肿瘤转移密切相关,与年龄、性别和肿瘤分期无关;与正常胃粘膜细胞RGM-1和NGEC相比,胃癌细胞HS746T中的miR-10a表达降低,而Tiam1蛋白表达升高;miR-10a可抑制HS746T细胞侵袭,促进细胞凋亡,使其停滞于G0/G1期;miR-10a靶向作用于Tiam1基因的3'非翻译区(YUTR),减少Tiam1的蛋白表达;Tiam1可抑制HS746T细胞凋亡,促进HS746T细胞侵袭.结论:miR-10a靶向作用于Tiam1基因的YUTR,抑制HS746T细胞的增殖及侵袭,促进HS746T细胞凋亡.

目的:采用高效基因电转法,通过电转CRISPR/Cas9质粒建立巨噬细胞可诱导性C型凝集素(Mincle)敲除的RAW264.7巨噬细胞系,并探讨Mincle敲除对脂多糖刺激下巨噬细胞炎症的影响.方法:对融合度为80％的RAW264.7巨噬细胞实施px-458-Mincle质粒电转.电转后24 h观察荧光效果,并通过流式细胞分选仪得到荧光阳性细胞,挑选并培养出36个克隆测序,最终鉴定出敲除成功的细胞系.提取RNA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达,以及巨噬细胞极性标志物iNOS和CD206的表达.结果:摸索多个NEPA21电转仪对RAW264.7细胞电转条件,结果显示(300 V,5 ms)电转效果最佳,最高转染率高达30.7％.挑选的36个细胞克隆通过测序显示,突变率为58.33％,纯合子突变率为22.22％,敲除成功率为16.67％(缺失碱基数非3的倍数).Western blot和免疫荧光检测验证Mincle蛋白表达缺失,说明敲除成功.与未敲除细胞相比,Mincle敲除细胞在脂多糖(100 ng/ml)刺激下,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达显著降低(P<0.001),抑制炎症的因子IL-10表达增加(P<0.01),M1型巨噬细胞标志物iNOS表达显著降低(P<0.001),M2型巨噬细胞标志物CD206则大幅增加(P<0.001).结论:高效电转仪NEPA21可用于免疫细胞等难转细胞的转染.Mincle在巨噬细胞中的敲除能显著降低脂多糖刺激的细胞炎症,提示Mincle在巨噬细胞炎症中的重要作用.

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAl和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染人Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异.结果 成功构建了Rho GDIot的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1 的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P＜0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P＜0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高.结论 CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移.