目的:探讨T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)对肝癌细胞迁移和黏附的影响及其机制。方法:选取2015年6月到2018年6月南阳医学高等专科学校第一附属医院手术切除的104例肝癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用蛋白质印迹法(Western blot)和荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析肿瘤组织和癌旁组织中Tiam1蛋白和mRNA表达水平；采用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR-Cas9)技术在肝癌细胞株HepG2和MHCC-97H中建立Tiam1敲除细胞株，分别命名为HepG2 Tiam1 KO组和HepG2对照组；MHCC-97H Tiam1 KO组和MHCC-97H对照组。采用Transwell分析肝癌细胞迁移能力；采用基质黏附实验分析肝癌细胞的黏附能力；采用Western blot分析迁移和黏附相关蛋白的表达水平。组间比较采用 t检验。 结果:与癌旁组织中Tiam1蛋白和mRNA表达水平(1.49±0.21、1.07±0.19)比较，肝癌组织中Tiam1蛋白和mRNA表达水平(3.10±0.37、2.87±0.31)显著增加，差异有统计学意义( t＝3.058、2.891， P<0.05)。与HepG2对照组和MHCC-97H对照组细胞迁移数量[(142.17±20.48)、(169.10±24.19)个]比较，HepG2 Tiam1 KO组和MHCC-97H Tiam1 KO组细胞迁移数量[(76.91±9.87)、(91.55±7.52)个]显著下降，差异有统计学意义( t＝4.128、3.944， P<0.05) 。与HepG2对照组和MHCC-97H对照组细胞黏附能力(142.17±20.48、169.10±24.19)比较，HepG2 Tiam1 KO组和MHCC-97H Tiam1 KO组细胞黏附能力(76.91±9.87、91.55±7.52)显著下降，差异有统计学意义( t＝4.128、3.944， P<0.05)。与HepG2对照组和MHCC-97H对照组细胞黏着斑激酶(FAK)蛋白表达水平(1.09±0.19、1.59±0.24)比较，HepG2 Tiam1 KO组和MHCC-97H Tiam1 KO组细胞FAK蛋白表达水平(0.39±0.11、0.44±0.19)显著下降，差异有统计学意义( t＝3.208、3.011， P<0.05)。 结论:Tiam1通过影响FAK蛋白表达水平，进而调控肝癌细胞的迁移和黏附能力。

目的:应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法:选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型，设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003，应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞，48 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出效率最高者crRNA001，并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板；用crRNA001和ssODN共转染肝细胞，模板特异性引物行PCR，验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。 结果:Sanger测序结果显示，crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后，模板特异性引物行PCR，能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带；二代测序结果显示，ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论:CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率，相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因，为进一步的体内实验提供理论和实验基础。

目的 明确转染了规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)表达质粒的细胞所分泌的外泌体中是否存在单链向导RNA (gRNA)和Cas9蛋白,并探索CRISPR/Cas9系统能否通过外泌体的细胞间传递,实现对周围细胞靶基因的编辑.方法 (1)将CRISPR/Cas9表达质粒转染至HuH7细胞中,收集细胞培养上清液,差速离心法浓缩和纯化外泌体,通过电镜和马尔文激光散射粒度测定仪分别测定外泌体的形态和粒径,并利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测gRNA和Cas9蛋白水平.(2)将分别转染1.2x乙型肝炎病毒(HBV)表达质粒和HBV特异性CRISPR/Cas9表达质粒的HuH7细胞进行共培养.2d后提取细胞内HBV DNA,经PCR扩增后测序. 结果 转染CRISPR/Cas9表达质粒的HuH7细胞所产生的外泌体中不仅存在全长gRNA和Cas9蛋白,并可在细胞间传递其基因编辑功能,实现对周围细胞HBV基因组的破坏. 结论 作为一种潜在的递送系统,外泌体可通过携带有功能的gRNA和Cas9蛋白在细胞间传递CRISPR/Cas9系统的基因编辑功能.这一现象也提示我们,在利用CRISPR/Cas9系统进行基因治疗的过程中,也需要考虑携带有gRNA和Cas9蛋白的外泌体对周围及远端组织细胞的潜在影响.

目的 构建小鼠Spata7基因视网膜内敲除模型,探讨Spata7基因突变导致光感受器细胞凋亡的机制.方法 以腺相关病毒(AAV)为载体搭载CRISPR/Cas9系统,注射1μL AAV病毒混合液(3×1013 vg/mL)于出生14 d小鼠视网膜中,对Spata7基因进行视网膜内特异性敲除.1个月后行视网膜眼底照相观察AAV感染效率;定量PCR测定敲除效率;视觉电生理检测光感受器细胞功能;免疫荧光实验探究Spata7基因功能.结果 AAV有效搭载CRISPR/Cas9系统进入视网膜内并对Spata7基因进行敲除,敲除效率为54％.小鼠光感受器细胞大量死亡,导致整体光感受器细胞功能明显下降.敲除后,视紫红质无法被转运到光感受器细胞外节,引起明显的内质网应激.结论 Spata7基因敲除导致视紫红质蛋白运输到外节受阻而停留在内质网,并造成内质网应激,是导致光感受器细胞大量死亡的重要原因.

目的 通过规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统敲减人肝癌细胞系Hep12中电压依赖性钙离子通道α2δ1的表达,观察α2δ1敲减后对肝癌细胞干性的影响.方法 设计3对靶向α281的向导(sgRNA),长度为20 bp,构建到lenti CRISPRv2-puro载体上,然后在体外检测sgRNA切割活性,利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒,将包装好的病毒感染Hep-12细胞,2 d后加入嘌呤霉素筛选.利用Western blotting验证α2δ1的敲减效果和干性相关基因的表达.通过成球实验检测其体外自我更新能力的变化.结果 测序结果显示,sgRNA成功插入载体质粒;体外切割实验显示,3条sgRNA均有切割活性;Western blotting结果显示,α2δ1基因的表达显著降低,干性相关基因B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1(BMI1)和Nanog的表达显著被抑制;无血清培养基成球实验结果表明,敲减α2δ1导致Hep-12细胞的体外自我更新能力减弱.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建敲除α281基因的Hep-12细胞系;敲除α2δ1基因后能抑制Hep-12细胞肿瘤干细胞样特性.

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAl和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染人Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异.结果 成功构建了Rho GDIot的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1 的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P＜0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P＜0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高.结论 CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移.

目的 构建靶向叉头框蛋白J2(FOXJ2)的规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因敲除质粒,探讨干扰FOXJ2基因后对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的信号通路转化生长因子β/Smads家族蛋白(TGF-β/Smads)表达和增殖的影响.方法 设计小鼠FOXJ2的小向导RNA(sgRNA)序列,与PX458载体连接并转化感受态大肠埃希菌,挑取单克隆扩增提质粒.利用脂质体将重组质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs转染入肝癌细胞Hepa1-6,对照组只转染空载体,48 h后RT-PCR检测对Hepa1-6细胞FOXJ2的抑制作用,同时检测FOXJ2被抑制后TGF-β和Smads的表达情况;MTT法检测干扰FOXJ2后对肝癌细胞增殖能力的影响.结果 成功构建3个FOXJ2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs,其中质粒PX458-FOXJ2-sgRNA2可以有效抑制FOXJ2的表达,同时检测到干扰了FOXJ2的细胞的TGF-β、Smad2和Smad4的表达均高于对照组,差异显著;并且FOXJ2被抑制组肝癌细胞的增殖能力明显提高.结论 小鼠肝癌细胞中的FOXJ2基因在一定程度上抑制TGF-β、Smad2和Smad4基因的表达,抑制细胞的增殖,推测在体情况下,肝癌细胞的增殖和TGF-β信号通路的激活与FOXJ2基因的负调控有一定的相关性,FOXJ2可以作为肝癌预防和治疗的靶点分子进行干预.

目的 探讨热休克蛋白Gp96对小鼠酒精性肝纤维化的影响.方法 健康雄性C57BL/6 J小鼠220只,随机分为4组:正常对照组(n=10),生理盐水+酒精诱导纤维化组(n=70).尾静脉注射CRISPR表达质粒Gp96-sgRNA3+酒精诱导肝纤维化组(n=70),腹腔注射核因子KB(NF-KB)抑制剂PDTC+酒精诱导肝纤维化组(n=70).于酒精诱导第8周眼球取血后处死各组小鼠,测定各组小鼠血清谷草转氨酶(AST)活性,HE染色检测各组小鼠肝脏病理变化,天狼猩红染色检测各组小鼠肝纤维化情况,过碘酸-雪夫(PAS)染色检测各组小鼠肝糖原变化情况;免疫印迹法检测小鼠肝脏Gp96和转化生长因子β1(TGF-[31)的表达变化.结果 与正常对照组相比,其余3组AST酶活性显著上升,肝纤维化加重,糖原显著减少(P＜0.01);与生理盐水+酒精组相比,注射质粒Gp96-sgRNA3+酒精组和注射NF-κB抑制剂+酒精组AST上升更为明显,肝纤维化更严重,糖原减少更多,Gp96表达显著下降,TGF-β1表达显著增加(P＜0.01或P＜0.05).结论 尾静脉注射CRISPR表达质粒Gp96-sgRNA3显著抑制了小鼠肝脏Gp96的表达,促进了小鼠酒精性肝纤维化程度,NF-κB信号通路对Gp96的表达起到一定的调控作用.

Meesmann角膜上皮营养不良(MECD)是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病,其特征性表现为角膜上皮存在大量的微囊.角蛋白(KRT)3基因和KRT12基因杂合错义突变是MECD的主要致病机制,可导致细胞骨架蛋白KRT3和KRT12结构改变,进而导致角膜上皮和前弹力层发生病理性改变.目前,手术治疗是反复发作或症状严重的MECD患者的主要治疗方式,但易复发.而针对小干扰RNA、规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9基因编辑技术等的基因治疗在疾病模型中可以有效减少相应KRT12蛋白的表达.因此,未来应进一步深入研究MECD的发病机制以及基因技术在MECD治疗中的应用.

目的 利用CRISPR/Cas9系统敲除小鼠水通道蛋白9(AQP-9)基因,构建稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9-/-小鼠.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,在Ensembl数据库上找到AQP-9基因序列的外显子区域,综合分析选定AQP-9-202的公共外显子2,前期在其两边设计7个小向导RNA (sgRNA)靶点,选择合适靶点,将AQP-9敲除.用PCR以及基因测序手段检测基因敲除效果.获得F1代杂合子小鼠后,继而提供10只野生型小鼠(雌雄各5只)进行繁育,以期得到纯合子AQP-9-/-小鼠.结果 前期设计的7个sgRNA靶点基因活性均在95％以上,选择L2和R2作为最终的sgRNA靶点.注射受精卵74枚,移植60枚,得到6只F0代阳性鼠.经过繁育鉴定,最终得到稳定敲除AQP-9基因的纯合子AQP-9-/-小鼠.结论 利用CRISPR/Cas9系统获得全身敲除AQP-9基因且可稳定遗传的纯合子AQP-9-/-小鼠.