目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

目的 建立基于TaqMan探针的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)E301R基因荧光定量PCR(fluo-rescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法,并进行验证,以期应用于临床样本中ASFV的检测.方法 通过对ASFVE301R基因序列进行分析,选择基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针.PCR扩增E301R基因片段,克隆至pCAGGS载体,构建质粒标准品,建立基于TaqMan探针的qPCR检测方法,并验证方法的线性范围、精密性、特异性、敏感性及准确性.采用建立的方法检测92份临床样本,并与商品化ASFV荧光PCR试剂盒检测结果进行比较.另采用建立的方法对E301R基因转录动力学进行分析.结果 质粒标准品在1.6×(101～108)拷贝/μL范围内,与Ct呈良好的线性关系,线性回归方程为:y=-3.239 x+40.774,R2=0.994;重复性及中间精密性验证CV均＜2％;除 ASFV外,猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and re-spiratory syndrome virus,PRRSV)、伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)均未出现扩增曲线;最低可稳定检出1.6× 101拷贝/μL的质粒标准品;浓度为1.6× 102和1.6× 101拷贝/μL质粒标准品的加标回收率在90％～110％之间.建立的方法与商品化ASFV荧光PCR试剂盒对92份临床样本检测结果的符合率为96.7％(Kappa=0.932,P=1.000).E301R基因可能为ASFV感染的中期转录基因.结论 建立的基于TaqMan探针的qPCR检测方法具有良好的精密性、特异性、敏感性及准确性,可用于临床样本中ASFV的检测.

目的 构建真核细胞延长因子2(eukaryotic elongation factor 2,eEF2)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,为后续研究eEF2在乳腺癌细胞发生发展中的作用提供实验依据.方法 根据eEF2的基因序列和短发夹RNA序列的设计原则设计合成3对shRNA序列,将shRNA序列复性后插入慢病毒载体LV-U6-shR-NA-ZSgreen-Puro,构建3种不同eEF2基因敲低靶点的重组质粒sh1、sh2、sh3,以空载体作为阴性对照组(shNC).采用慢病毒三质粒包装系统共分别转染人肾上皮细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增.经酶切及测序验证正确后,将重组慢病毒感染对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7,72h后荧光显微镜观察绿色荧光强度,实时荧光定量PCR(qPCR)法检测eEF2 mRNA转录水平,Western blot法检测eEF2蛋白表达水平.结果 eEF2 shRNA载体测序与原设计序列完全一致.重组慢病毒感染的MCF-7中可见绿色荧光蛋白表达.与shNC组相比,eEF2敲低的sh2和sh3组MCF-7细胞中eEF2 mRNA的转录水平明显降低(t分别为9.244和5.938,P分别为0.001和0.004);sh1、sh2和sh3组细胞中eEF2蛋白的表达水平均明显降低(t分别为3.552、9.614和4.432,P分别为0.024、0.001和0.011).结论 成功构建了eEF2基因低表达的慢病毒质粒及稳定转染的乳腺癌细胞模型,有望为临床乳腺癌的治疗提供基于翻译靶向治疗的新靶点.

目的 通过噬菌体展示技术,从免疫骆驼的外周淋巴血液中获得与RSPO1结合的纳米抗体,纯化后构建RSPO1噬菌体展示文库,并进行免疫淘选.方法 将RSPO1基因与pCMV-Fc载体连接后,构建质粒RSPO1-pCMV-Fc,瞬时转染 HEK-293F 细胞,表达 RSPO1 蛋白;经 Protein A 凝胶柱、HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200pg 柱、Super-dexTM 24 Increase10/300GL柱依次纯化RSPO 1蛋白后,免疫骆驼,收集外周血并分离淋巴细胞;提取细胞RNA,反转录合成cDNA,通过2步巢式PCR扩增VHH片段,克隆至pMECS噬菌粒载体中,构建噬菌体展示文库,经2轮淘选使与RSPO1结合的噬菌体得到聚集后,进行ELISA鉴定并测序.结果 质粒RSPO1-pCMV-Fc经PCR及测序鉴定证明构建正确.表达的RSPO1蛋白相对分子质量约172 000,纯度约为70％;RSPO1噬菌体展示文库库容为1.2× 108cfu,经2轮淘选使噬菌体富集度达到12;共获得19个纳米抗体序列.结论 获得了多样性良好的纳米抗体序列,为了解与RSPO1相关的Wnt信号通路提供了可能.

目的 利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶(CV2025)基因序列构建重组质粒pET-28a-CV2025,并在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中进行原核表达.方法 将CV2025基因序列与pET-28a(+)载体连接,构建重组质粒pET-28a-CV2025,转化E.coliTOP10中进行阳性克隆子筛选,经双酶切及测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,诱导表达目的蛋白;将重组菌28a-CV2025-BL21活化后接种2TY液体培养基,IPTG诱导表达制备粗酶液后,以异丙胺为氨基供体,1-(4-甲氧苯基)乙酮、邻氟苯乙酮、苯乙酮为氨基受体,采用薄层色谱法监测反应,初步检验转氨酶活性,高效液相色谱法进行进一步分析.结果 重组质粒pET-28a-CV2025经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组菌28a-CV2025-BL21、28a-CV2025-Rosetta的表达产物均可见相对分子质量约51 000的目的蛋白条带,且28a-CV2025-BL21表达的蛋白大部分以可溶性形式存在;酶液催化后,1-(4-甲氧苯基)乙酮与异丙胺发生转氨基化反应,生成对应的手性胺1-(4-甲氧苯基)乙胺,具有一定的催化活性.结论 在E.coli中成功表达了CV2025,初步检验上清中可溶性蛋白具有酶活性,为后期转氨酶的分离、纯化以及增强产物转化率奠定了基础.

目的 将二代测序(next generation sequencing,NGS)技术应用至Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(Vero细胞)(Sabin strain inactivated poliomyelitis vaccine,sIPV)生产质量监控中,以期确保疫苗的安全性和批间一致性.方法 将脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)Sabin株Ⅰ型、Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型工作种子批分别接种至生物反应器微载体培养的单层Vero细胞上,33 ℃培养3～4d,获得疫苗代次病毒液,每个型别制备3批.提取各型别工作种子批毒种和疫苗代次病毒液RNA,用NGS技术分析基因突变频率、神经毒力决定位点、突变热点及批间一致性.结果 3种型别PV工作种子批毒种经培养后,Sabin株Ⅱ型和Pfizer株Ⅲ型比Sabin株Ⅰ型更易发生突变,非编码区神经毒力决定位点突变频率明显上升(t=3.21～5.83,P均＜0.05),编码区神经毒力决定位点突变频率变化较小(t=1.29～2.34,P均＞0.05)或明显下降(t=6.01～9.62,P均＜0.05);Sabin株Ⅱ型毒株的nt869位点及Pfizer株Ⅲ型毒株的nt2 493位点各发生1个突变热点,突变方式均为C→T,其中nt2493既是神经毒力决定位点,也是突变热点.3种型别各3批疫苗代次病毒液均具有良好的批间一致性,基因组VP1区域各核酸位点突变频率批间拟合R2为0.947～0.995.结论 NGS技术可高效检测sIPV生产过程中PV基因组的突变,且稳定可靠,可用于该疫苗的质量控制.

目的 探讨姜黄素对高糖环境下人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响及其机制.方法 将培养的hBMSCs分为正常组、高糖组和高糖+姜黄素组.通过检测碱性磷酸酶(ALP)活性评估各组细胞早期成骨分化水平;茜素红染色评估成骨分化晚期矿化结节的形成情况;RT-PCR检测成骨诱导分化21 d后成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原蛋白(COL-1)的表达;采用Western blot检测各组细胞中血红素氧合酶-1(HO-1)的表达;进一步构建HO-1小干扰RNA(siRNA)模型并检测干扰效率,对比高糖+姜黄素组和高糖+姜黄素+siHO-1组成骨相关蛋白(Runx2、OCN和COL-1)的表达水平.结果 与正常组比较,高糖组细胞ALP活性降低,矿化结节形成减少,成骨相关基因(Runx2、OCN、COL-1)表达下降,HO-1的表达受到抑制(P＜0.05);与空载体组相比,siHO-1组HO-1表达显著下降,表明siRNA干扰成功(P＜0.01).相比高糖+姜黄素组,高糖+姜黄素+siHO-1组成骨相关蛋白(OCN、COL-1和Runx2)的表达水平均下降(P＜0.05).结论 姜黄素可改善高糖环境下hBMSCs的成骨分化能力,且与HO-1的表达有关.

目的 探究环磷酸腺苷(cAMP)信号通路在生长抑素受体5(SSTR5)激活对垂体催乳素腺瘤激素分泌抑制作用中的调控机制.方法 使用构建的SSTR5过表达GH3细胞系作为垂体催乳素腺瘤的体外细胞模型,采用不同浓度SSTR5激动剂BIM23052联合cAMP激动剂Forskolin(5 μmol/L)或百日咳毒素(10 nmol/L)进行细胞刺激,或联合转染过表达环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)作为干预.通过荧光素酶报告基因系统检测不同刺激组间PRL-luc、环磷酸腺苷反应元件(CRE)-Luc、Pit1-Luc、AP1-Luc和雌激素反应元件(ERE)-Luc启动子活性,Renilla荧光素酶基因用作内参以标准化转染效率.组间统计分析采用Student's t检验和单向方差分析.结果 为验证GH3细胞中SSTR5过表达的有效性,使用cAMP响应元件报告载体进行监测,GH3SSTR5细胞中CRE 报告基因活性显著低于 GH3mock 组[(74.87±6.66)％比(100.00±5.21)％,t=5.15,P＜0.05],提示SSTR5过表达显著抑制CRE转录活性.不同浓度BIM23052(0、0.1、1.0、10.0、100.0nmol/L)联合Forskolin(5 μmol/L)预处理GH3SSTR5细胞,CRE报告基因活性分别为(100.00±2.23)％、(17.79±2.30)％、(6.25±0.37)％、(25.27±2.99)％、(44.60±3.25)％,提示BIM23052降低了 Forskolin诱导的CRE转录活性,呈现U型剂量响应曲线,在1.0 nmol/L时抑制效果最强(t=71.68,P＜0.01).此外,Pit1启动子包含CRE元件,与未添加BIM23052和Forskolin组[CRE 报告基因活性(100.00±4.24)％]比较,不同浓度 BIM23052(0、0.1、1.0、10.0、100.0 nmol/L)联合Forskolin(5 μmol/L)预处理GH3SSTR5细胞,Pit1报告基因活性分别为(317.91±9.03)％、(278.11±4.94)％、(250.72±14.33)％、(176.21±8.88)％、(162.34±7.54)％,表明 BIM23052 处理同样降低了 GH3SSTR5细胞中Forskolin诱导的Pit1启动子活性,且这种降低具有剂量依赖性(P＜0.01).然而,BIM23052和百日咳毒素处理对Prl启动子上的其他响应元件,如AP1或ERE(雌激素反应元件),并未表现出明显抑制作用(P＞0.05).过表达CREB后,Prl启动子活性从空白转染组[Ctrl 组(100.00±12.01)％比 BIM 组(63.02±15.35)％,t=5.10,P＜0.01]到 CREB 过表达组[Ctrl组(102.17±11.80)％比 BIM 组(106.27±14.62)％,t=0.58,P＞0.05].结论 在垂体催乳素腺瘤中,SSTR5通过抑制cAMP-CREB途径来调控催乳素合成.

目的 探讨可溶性生长刺激表达基因 2 蛋白(sST2)对缺血性心肌病(ICM)大鼠心室重塑的调控作用.方法 采用左侧冠状动脉结扎法建立ICM大鼠模型,随机分为模型组(15 只)、空载体组(15 只)及用药组(15 只),另设假手术组(15 只);空载体组皮下注射 1 mL空载腺病毒,用药组皮下注射1mL腺病毒sST2载体诱导sST2过表达,模型组及假手术组皮下注射等量生理盐水,所有大鼠连续给药 2 d后正常饲养 1 周.所有大鼠均在末次给药后 1 周通过超声心动图检查心室重塑指标[左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期内径(LVESd)、室间隔舒张末期厚度(IVSd)],并检测血清sST2、心肌损伤标志物[心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]及炎症指标[白细胞介素(IL)-33、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平,同时通过苏木精-伊红(HE)染色实验与Masson染色实验观察大鼠心肌组织病理变化及心肌纤维化程度,并通过免疫组化实验检测心肌组织中sST2表达情况.sST2 表达水平与炎症指标及心室重塑指标的相关性应用Pearson相关性分析.结果 与假手术组相比,模型组及空载体组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞间隙较大,心肌细胞间质胶原沉积较为明显,用药组大鼠心肌细胞排列更加不规则,细胞间隙更大,间质胶原沉积更多.模型组、空载体组及用药组LVEF、IL-33 低于假手术组,且用药组上述指标低于模型组与空载体组(F=618.974、28.151,P<0.05);模型组、空载体组及用药组LVEDd、LVESd、IVSd、sST2、cTnI、CK、CK-MB、IL-6、TNF-α水平高于假手术组,且用药组上述指标高于模型组与空载体组(F=3.665、3.418、122.807、36.596、101.736、37.573、79.716、20.371、51.494,P<0.05);模型组、空载体组及用药组心肌组织中sST2表达水平高于假手术组,且用药组高于模型组与空载体组(F=122.843,P<0.05);ICM大鼠血清及心肌组织中sST2 水平与心室重塑指标LVEF及炎症指标IL-33呈负相关(P<0.05),与LVEDd、LVESd、IVSd、IL-6、TNF-α呈正相关(P<0.05).结论 sST2与ICM大鼠心室重塑有关,sST2高表达会促进大鼠心室重塑进程.

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建SLC19A2基因敲除的纯合子小鼠模型,并验证其表型.方法 设计gRNA载体,将构建好的gRNA载体和Cas9载体进行体外转录后共注射到受精卵,经胚胎移植后获得6只(雌性3只、雄性3只)阳性F0代小鼠.通过繁育获得12只(雄性6只、雌性6只)SLC19A2基因敲除纯合子小鼠[SLC19A2-/-小鼠(C57BL/6)].8周龄野生型C57BL/6小鼠和SLC19A2-/-小鼠各12只(雄性6只、雌性6只),分别设为野生型组与基因敲除纯合子组.采用PCR扩增凝胶电泳法鉴定小鼠基因型;采用实时荧光定量PCR检测胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测胰腺组织和肝脏组织中THTR-1蛋白表达.结果 PCR扩增凝胶电泳法成功鉴定出SLC19A2-/-小鼠.基因敲除纯合子组胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA及THTR-1蛋白表达水平低于野生型组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 基于CRISPR/Cas9技术成功构建了 SLC19A2基因敲除小鼠.