目的:研究传统中药材全蝎三种热稳定性多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的消化酶抗性.方法:结合重组表达、消化酶耐受实验、高效液相色谱技术及结构分析,评价多肽BmKcug2、BmKcug2-P1 和Martentoxin-P2 的肠胃蛋白酶稳定性.结果:多肽BmKcug2 对胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶都有很好的稳定性;多肽BmKcug2-P1 对胃蛋白酶稳定性较好,对胰蛋白酶也具有一定的抗性,但对α-胰凝乳蛋白酶稳定较差;多肽Martentoxin-P2 的酶稳定性谱与BmKcug2-P1 类似.结论:本研究发现了全蝎毒腺中存在多肽能够耐受肠胃蛋白酶的消化作用,阐明了全蝎毒腺中多肽的消化酶稳定性,为深入研究全蝎中有效药用成分提供了思路,为系统研究全蝎多肽活性成分和口服给药途径之间的关系奠定了基础.

目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:建立猪带绦虫（Ts）14-3-3.2原核表达系统，并观察Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。方法:在遵义医科大学寄生虫学教研室前期获得Ts14-3-3.2基因序列的基础上，采用基于PCR的精确合成（PAS）方法全基因合成Ts14-3-3.2基因，经限制性内切酶 NdeⅠ和 XbaⅠ双酶切后连接质粒pCzn1，构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2。将重组质粒转化至大肠埃希菌ArcticExpress感受态细胞中诱导表达，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析和鉴定表达产物，通过镍（Ni）柱亲和纯化获得纯化Ts14-3-3.2重组蛋白。采用该纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔，制备Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体，采用免疫印迹法（Western blot）检测Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中的表达情况。 结果:成功构建重组质粒pCzn1-Ts14-3-3.2，诱导表达后菌体上清液和沉淀均在相对分子质量约29.31 × 10 3处出现Ts14-3-3.2目的蛋白条带。纯化后带有His标签的Ts14-3-3.2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别，获得效价为1∶512 000的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Western blot结果显示，Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴中均有表达。 结论:成功建立Ts14-3-3.2原核表达系统，获得了高纯度、高效价的Ts14-3-3.2重组蛋白多克隆抗体。Ts14-3-3.2蛋白在Ts成虫和囊尾蚴阶段均有表达。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。

目的:确定钩端螺旋体LA_RS06960基因产物蛋白具有磷酸二酯酶(PDE)活性，确定该酶降解的底物细菌二核苷酸可激活巨噬细胞固有免疫因子。方法:PCR扩增钩端螺旋体56601株LA_RS06960基因并构建原核表达系统。通过Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白rPDE。高效液相色谱法(HPLC)检测rPDE降解细菌二核苷酸c-di-AMP或5′-pApA底物为AMP的活性。荧光定量RT-PCR法检测钩端螺旋体感染巨噬细胞过程中钩体LA_RS06960基因和细胞固有免疫相关因子基因mRNA水平变化。采用荧光定量RT-PCR法和ELISA法检测细菌二核苷酸影响细胞固有免疫相关因子表达及分泌水平变化。结果:成功构建钩端螺旋体LA_RS06960基因原核表达系统，纯化的rPDE具有体外降解5′-pApA和c-di-AMP为AMP的功能。钩端螺旋体感染巨噬细胞过程中，钩体LA_RS06960基因表达水平显著下降，巨噬细胞IFN-β、TNF-α、IL-6以及IL-1β编码基因表达水平均显著升高。LA_RS06960编码的PDE酶降解底物细菌二核苷酸可诱导IFN-β和IL-6基因mRNA表达水平或蛋白分泌水平的升高。结论:LA_RS06960基因产物PDE具有PDE活性，其水解底物细菌二核苷酸激活巨噬细胞固有免疫应答。

目的:利用汉逊酵母系统重组表达人细小病毒B19(human parvovirus B19, B19V)主要衣壳蛋白VP2，并对VP2病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)进行理化性质研究及免疫效果评价。方法:重组表达B19V VP2蛋白，并使其自组装成VLP；通过高密度发酵和系列层析纯化步骤获得VP2-VLP；SDS-PAGE和凝胶过滤高效液相色谱检测蛋白质纯度，动态光散射和透射电镜观察颗粒形态，并检测VP2-VLP磷脂酶活性。采用ELISA和红细胞凝集抑制试验检测小鼠体内VP2-VLP特异性IgG抗体和中和抗体水平。结果:本研究制备的重组VP2-VLP纯度大于95%，颗粒均一且形态良好，大小近似天然病毒颗粒；VLP可与特异性单克隆抗体结合，磷脂酶A2活性为阴性；吸附佐剂后的VP2-VLP能够诱导小鼠产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体。结论:汉逊酵母表达系统制备的B19V VP2-VLP可作为候选靶抗原用于B19V预防性疫苗的开发。

目的:原核表达GII.4基因型人诺如病毒(human norovirus, HuNoV)次要衣壳蛋白VP2并制备多克隆抗体。方法:设计特异性引物扩增GII.4 HuNoV的VP2全基因，酶切连接至原核表达载体pGEX-6P-1，将鉴定正确的重组质粒转化 BL21( DE3)感受态细胞。挑取单克隆摇菌，加入IPTG诱导重组GST-VP2融合蛋白的表达，经GST亲和层析纯化和酶切，获得GII.4 HuNoV VP2蛋白。通过SDS-PAGE分析纯化后HuNoV VP2蛋白相对分子质量。将纯化的GII.4 HuNoV VP2蛋白(0.5 mg/ml)免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体。 结果:GII.4 HuNoV VP2蛋白被成功表达和纯化，相对分子质量(Mr.×10 3)约29。将GII.4 HuNoV VP2蛋白免疫BALB/c小鼠制备的多克隆抗体滴度高达1∶1 280 000。Western blot与间接ELISA分析显示该多克隆抗体能和GII.4 HuNoV VP2抗原特异性结合。 结论:利用原核表达系统成功表达了GII.4 HuNoV VP2蛋白，并成功制备出高效价GII.4 HuNoV VP2多克隆抗体。

近年来，戊型肝炎逐渐被认为是被低估的全球疾病负担。感染导致相关损伤或死亡较严重的人群包括孕妇、有基础肝病的患者和老年人。疫苗是预防戊型肝炎病毒（HEV）感染的最有效手段。由于缺乏高效的HEV细胞培养系统使得开发灭活或减毒疫苗不可行，因此研究者们对重组疫苗进行深入研究。HEV中和位点几乎完全位于病毒粒子的开放式阅读框2所编码的衣壳蛋白（pORF2）中。基于pORF2的许多候选疫苗显示出保护灵长类动物的潜力，其中两种在成人中耐受性良好，对预防戊型肝炎高度有效。全球首个戊型肝炎疫苗239（HEV Hecolin ?疫苗）于2012年在中国获批上市。

目的:利用规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein 9，Cas9)技术对痘苗病毒(vaccinia virus, VACV)胸腺激酶(thymidine kinase，TK)区进行定向重组，建立高效的痘苗病毒靶基因插入重组技术。方法:设计合成靶向TK区的引导RNA(guide RNA, gRNA)对应的2条互补寡核苷酸，磷酸化修饰后变性退火，克隆到去除核定位信号的PX458载体上，同时改造原有TK区重组质粒。将gRNA及Cas9共表达质粒转染293T细胞，介导VACV与TK区重组质粒进行同源重组，然后通过蓝白斑的出现率评估病毒重组率。结果:本研究中设计并合成的gRNA序列介导的重组效率大于1%，高于经典的同源重组方法10倍以上。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了高效痘苗病毒TK区重组体系，为新发突发传染病的疫苗或多价研究以及肿瘤治疗等提供临床前研究技术支持。