目的 分析了解深圳市输入性恶性疟原虫耐药基因突变情况,帮助评估抗疟药的疗效和指导有效用药.方法 收集2022-2023年从境外输入深圳市的恶性疟荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)阳性的样本85例,提取基因组DNA,使用巢式PCR扩增耐药基因:恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(Plasmodium falciparum Kelch 13,PfK13)、多药耐药基因 1(multidrug resistance 1,Pfmdr1)、氯喹抗性转运基因(chloroquine resistance transporter,Pfcrt)、二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase,Pfdhfr)和二氢蝶酸合成酶基因(dihydropteroate synthase,Pfdhps),并进行双向测序,使用MEGA11.06软件分析这些耐药基因突变情况.结果 研究发现PfK13错义突变(S549P)1例,同义突变4例.Pfmdr1 62.69％样本存在Y184F突变,未检测到N86Y突变体.Pfcrt基因中,未检测到72和73位点的突变,M74I、N75E和K76T突变分别占17.46％、15.87％和15.87％.Pfcrt基因野生型占主导(82.54％,52例),其次是I74E75T76三重突变体(15.87％,10例).Pfdhfr最常见的突变型为I51R59N108(91.78％,67例),其次是野生型(2.74％,2例).Pfdhps野生型占60.32％(38例),单突变K540E为最常见突变类型,检测到S436A、G437A、K540E、A581G、A613S、I431V、G556K、G579E位点突变.Pfdhfr-Pfdhps组合突变中,I51R59N108-E540是频率最高的组合突变(11.48％),59.02％样本为Pfdhfr单独突变体.结论 在本研究中,PfK13突变率低,且无报导的耐药突变,Y184F成为Pfmdr1突变主导,未发现有N86Y.Pfcrt野生型为主,其次为I74E75T76三重突变体,Pfdhfr I51R59N108三重突变非常普遍,本研究并未发现Pfdhfr-Pfdhps完全抗性和超抗性突变体,但有其他的五重七重突变型.在未来的工作中,需要继续加强疟原虫耐药基因的监测,同时进一步结合体内疗效的监测来有效指导临床用药.

目的 分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征.方法 收集河南省2012-2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序.获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为 PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200 和 PF3D7_1324800).使用 SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析.结果 2012-2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1 522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例.测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK1 3基因序列,基因突变率为8.8％(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C.测序获得91份恶性疟原虫样品的Pfcrt基因序列,基因突变率为18.7％(17/91);检测出 3 种Pfcrt 基因型,分别为野生型 C72V73M74N75K76(81.3％,74/91)、突变型 C72V73I74E75T76(12.1％,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6％,6/91).测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2％(71/92);检测出 3 个突变位点,分别为 N86Y(41.3％,38/92)、Y184F(75.0％,69/92)和 D1246Y(1.1％,1/92),其中 N86Y 突变率从2012年的 68.8％(11/16)下降到 2016年的 11.1％(1/9)(x2=11.58,P＜0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8％,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1％,1/92)、N86F184D1246(34.8％,32/92)、N86Y184Y1246(1.1％,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2％,37/92).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7％(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1％,82/90)、C59R(93.3％,84/90)和S108N(96.7％,87/90);检测出 5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3％,3/90),单基因突变型 N51C59N108(2.2％,2/90),双重突变型 I51C59N108(1.1％,2/90)、N51R59N108(3.3％,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0％,81/90).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8％(88/90);检测出 6个突变位点,分别为 1431V(8.9％,8/90)、S436A(27.8％,25/90)、A437G(92.2％,83/90)、K540E(3.3％,3/90)、A581G(1.1％,1/90)和 A613S(2.2％,2/90);检测出 8 种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2％,2/90),单基因突变型 I436A436A43(5.6％,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7％,60/90),双重突变型 I431A436G437K540A581A613(10.0％,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3％,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9％,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1％,1/90)和 I431A436G437K540A581S613(2.2％,2/90).89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4％)同时发生双基因突变,四重突变体I51R59N108-G437占比最高(64.0％,57/89).结论 自赤道几内亚输入的恶性疟原虫样品中检出多个PfKI3基因突变位点,其中M476I和P574L已被证实与青蒿素类药物抗性相关;随着氯喹的停用,与青蒿素配伍药物抗性相关的Pfcrt和Pfmdr1基因突变率呈下降趋势;恶性疟原虫对磺胺多辛-乙胺嘧啶药物抗性水平多为"部分抗性",未检出"超级抗性"样品.

目的 了解输入性恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗性基因1(pfmdr1)相关位点突变情况及其关联性.方法 2009-2016年,采集武汉市从非洲和东南亚等回国人员恶性疟患者血样,利用巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv对产物进行酶切,分析相关位点的突变性.结果 232例输入性恶性疟患者Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点的突变率分别为55.2％、17.2％、5.2％和8.6％,pfmdr1总突变率为26.3％;东南亚患者血样未检出pfmdr186和pfmdr11246位点突变;非洲输入性恶性疟患者Pfcrt76突变和未突变中pfmdr186、1042、1246位点及pfmdr1总突变率分别为28.6％、3.8％、12.4％、36.2％和10.4％、2.1％、7.3％、17.7％.患者症状与Pfcrt76、pfmdr186、1042、1246位点突变连锁不平衡分析,D′和r2分别为0.230和0.018、0.290和0.004、0.996和0.012、0.150和0.035.结论 输入地为非洲和东南亚缅甸的恶性疟原虫pfmdr1基因突变位点存在差异,Pfcrt76突变与pfmdr1突变和pfmdr186点突变呈正相关.

疟疾是严重威胁人类健康的主要传染病之一.尽管以青蒿素为基础的青蒿素联合疗法(ACT)能有效控制疟疾扩散及降低疟疾死亡率,但近年来不断发现的恶性疟原虫对青蒿素和ACT的耐药性引起了广泛的关注.通过回顾相关文献,本文综述了恶性疟原虫多药耐药性基因(Pfmdr1)、恶性疟原虫氯喹耐药性转运蛋白基因(Pfcrt)、恶性疟原虫钙ATP蛋白6基因(Pfp6)和恶性疟原虫K13基因(Pfkelch 13)及其他青蒿素耐药性机制的研究,为进一步探索疟原虫青蒿素耐药分子机制和监控耐药疟原虫的扩散提供参考.

目前恶性疟原虫几乎对所有抗疟药物都产生了抗药性,研究与恶性疟原虫抗药性相关的恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗药性基因(Pfmdr1)以及恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(K13)突变有助于建立快速有效的疟原虫抗药性分子监测技术,对实现全球消除疟疾目标有着重要的意义.本文对恶性疟原虫药物抗性基因研究现状进行了综述.

目的 了解中缅边境地区恶性疟原虫对抗疟药物的敏感性及其抗性相关基因多态性之间的关系,为当地制定合理的疟疾药物策略提供依据. 方法 2009年在缅甸拉咱市农日班诊所设立调查点,选取镜检为单一感染恶性疟原虫,2周内未用过抗疟药、磺胺和四环素类药物的现症患者为调查对象,给药前采集患者全血或滤纸血滴,用于体外药物敏感性测定和基因检测.运用Rieckmann体外微量测定法对恶性疟原虫进行体外青蒿素、氯喹、哌喹和咯萘啶敏感性检测.提取全血或滤纸血滴DNA,进行恶性疟原虫氯喹抗性转运基因(Pfcrt)、多药抗性基因(Pfmdr)和Kelch基因(PfK13)抗性相关基因检测.应用SPSS 23.0软件Spearman秩相关系数检验分析恶性疟原虫药物抗性与其携带基因之间的关系. 结果 共收集镜检为单一感染恶性疟原虫患者血样63份,体外药物敏感测定51例,成功测定42例,占82.4％.恶性疟原虫对氯喹的平均抑制浓度、半数抑制量(ID50)和抗性率较高,分别为880 nmol/L、320.5 nmol/L和95.2％;对咯萘啶平均抑制浓度、青蒿素ID50和哌喹抗性率较低,分别为410 nmol/L、84.8 nmol/L和7.1％.在对氯喹有抗性的40份血样中,对咯萘啶、青蒿素和哌喹的交叉抗性率分别为52.5％ (21/40)、37.5％ (15/40)和7.5％ (3/40);对哌喹有抗性的3份血样中,对氯喹、青蒿素和咯萘啶的交叉抗性率均为3/3.存在交叉抗性的血样从高到低分别为:氯喹与咯萘啶21份,氯喹与青蒿素15份,青蒿素与咯萘啶13份,哌喹与氯喹、青蒿素和咯萘啶均为3份.Spearman秩相关系数检验分析显示,青蒿素与哌喹和咯萘啶的抗性之间均存在相关性(r=0.354、0.446,P＜ 0.05).基因检测结果显示,Pfcrt基因成功测序37份,均为74～～76位点C72V73I74E75T76三重突变基因型,突变率为100％ (37/37).Pfmdr基因在第86和1246位点分别成功测序47和49份血样,突变率分别为N86Y (2.1％,1/47)和D1246Y(100％,49/49).PfK13基因成功测序20份,存在3种基因突变型,其中F446I突变率较高,占50.0％ (10/20),I492L/S和C580Y基因突变率较低,均为5.0％ (1/20).体外药物敏感性检测为抗性的血样中,Pfcrt基因C72V73I74E75T76、Pfcrt基因N86Y1246、PfK13基因I446S492C580和Pfcrt/Pfmdr基因I74E75T76/Y1246基因型频率较高,分别占各自的100％ (37/37)、93.9％ (46/49)、50.0％ (10/20)和69.0％ (29/42).Spearman秩相关系数检验分析显示,Pfcrt、Pfmdr和PfK13基因突变与体外药物敏感性间无相关性. 结论 缅甸拉咱市恶性疟原虫对氯喹已普遍产生了抗性,对咯萘啶和青蒿素具有一定抗性,但对哌喹仍然敏感.

目的 了解山东省由赤道几内亚输入的恶性疟原虫抗性基因多态性情况.方法 采集2015-2016年山东省由赤道几内亚务工返乡的输入性恶性疟患者血样,提取疟原虫基因组DNA,对恶性疟原虫抗性基因Pfcrt、Pfmdrl、Pfdhfr、Pfdhps、K13进行套式PCR扩增、DNA测序和序列对比分析.结果 全部样本5种抗性基因目的片段均成功扩增和测序.Pfcrt野生型、突变型、混合型分别占72.8％、18.6％、8.6％,突变型全部为CVIET(下划线表示突变位点,下同);Pfmdrl野生型、突变型、混合型分别占20.0％、61.4％、18.6％,突变型主要为YF和NF;Pfdhfr野生型、突变型、混合型分别占1.4％、98.6％、0,突变型主要为AIRNI;Pfdhps野生型、突变型、混合型分别占1.4％、94.3％、4.3％,突变型主要为SGKAA;Pfdhfr和Pfdhps完全抗性基因型IRNGE占8.6％;1.4％的样本K13基因发生A578S突变.结论 山东省由赤道几内亚输入的恶性疟原虫Pfcrt、Pfmdrl、Pfdhfr、Pfdhps、K13基因均发生不同程度突变;Pfcrt突变型比例较低,Pfmdr1、Pfdhfr、Pfdhps突变型比例较高;检测到K13基因发生A578S突变.

目的 调查赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫多药耐药蛋白1(Plasmodium falciparum multidrug resistance protein 1,PfMDRl)、氯喹抗性转运蛋白基因(P.falciparum chloroquine resistant transporter,PfCRT)和Kelch13基因(P.falciparum Kelch 13,PfK13)多态性,为当地疟疾防控策略制定提供参考.方法 采集2018-2019年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫感染者外周血样本85份,提取基因组DNA.采用巢式PCR技术扩增PfMDR1、PfCRT和PfK13基因,对扩增产物进行DNA测序,并对基因序列进行比对.结果 赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfK13基因不存在已知与青蒿素抗性相关的突变;PfMDR1基因和PfCRT基因均存在不同比例抗药性突变,其中PfMDR1_N86Y、PfMDR1_Y184F和PfCRT_K76T突变率分别为35.29％(30/85)、72.94％(62/85)和24.71％(21/85).结论 赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfMDR1、PfCRT基因和PfK13基因均存在不同程度突变.