目的 分析了解深圳市输入性恶性疟原虫耐药基因突变情况,帮助评估抗疟药的疗效和指导有效用药.方法 收集2022-2023年从境外输入深圳市的恶性疟荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)阳性的样本85例,提取基因组DNA,使用巢式PCR扩增耐药基因:恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(Plasmodium falciparum Kelch 13,PfK13)、多药耐药基因 1(multidrug resistance 1,Pfmdr1)、氯喹抗性转运基因(chloroquine resistance transporter,Pfcrt)、二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase,Pfdhfr)和二氢蝶酸合成酶基因(dihydropteroate synthase,Pfdhps),并进行双向测序,使用MEGA11.06软件分析这些耐药基因突变情况.结果 研究发现PfK13错义突变(S549P)1例,同义突变4例.Pfmdr1 62.69％样本存在Y184F突变,未检测到N86Y突变体.Pfcrt基因中,未检测到72和73位点的突变,M74I、N75E和K76T突变分别占17.46％、15.87％和15.87％.Pfcrt基因野生型占主导(82.54％,52例),其次是I74E75T76三重突变体(15.87％,10例).Pfdhfr最常见的突变型为I51R59N108(91.78％,67例),其次是野生型(2.74％,2例).Pfdhps野生型占60.32％(38例),单突变K540E为最常见突变类型,检测到S436A、G437A、K540E、A581G、A613S、I431V、G556K、G579E位点突变.Pfdhfr-Pfdhps组合突变中,I51R59N108-E540是频率最高的组合突变(11.48％),59.02％样本为Pfdhfr单独突变体.结论 在本研究中,PfK13突变率低,且无报导的耐药突变,Y184F成为Pfmdr1突变主导,未发现有N86Y.Pfcrt野生型为主,其次为I74E75T76三重突变体,Pfdhfr I51R59N108三重突变非常普遍,本研究并未发现Pfdhfr-Pfdhps完全抗性和超抗性突变体,但有其他的五重七重突变型.在未来的工作中,需要继续加强疟原虫耐药基因的监测,同时进一步结合体内疗效的监测来有效指导临床用药.

目的 分析河南省自赤道几内亚输入性恶性疟原虫抗药性基因多态性,了解恶性疟原虫基因突变情况,评估其流行特征.方法 收集河南省2012-2019年自赤道几内亚输入性恶性疟病例信息和外周血样,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Kelch 13螺旋体(PfK13)基因、恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因、恶性疟原虫多药物抗性基因1(Pfmdr1)、恶性疟原虫二氢叶酸还原酶(Pfdhfr)基因和恶性疟原虫二氢蝶酸合酶(Pfdhps)基因,琼脂糖凝胶电泳后进行双向测序.获得的基因序列通过MEGA7软件与参考基因组进行比较获得突变位点信息,参考基因组来自GenBank的恶性疟原虫3D7野生虫株(GenBank登录号分别为 PF3D7_1343700、PF3D7_0709000、PF3D7_0523000、PF3D7_0417200 和 PF3D7_1324800).使用 SPPS 21.0软件对数据进行统计学分析.结果 2012-2019年,河南省共报告输入性疟疾病例1 522例,其中自赤道几内亚输入病例117例,包括恶性疟病例97例、卵形疟病例16例、间日疟和三日疟病例各1例、恶性疟原虫/三日疟原虫混合感染和恶性疟原虫/卵形疟原虫混合感染病例各1例.测序获得91份恶性疟原虫样品的PfK1 3基因序列,基因突变率为8.8％(8/91);突变样品中共检测出7个非同义突变位点和3个同义突变位点,其中非同义突变位点分别为M476I混合型(混)、A481V混、A564E混、P574L混、A578S、V589I和N609I混,同义突变位点分别为G625G、N664N和C469C.测序获得91份恶性疟原虫样品的Pfcrt基因序列,基因突变率为18.7％(17/91);检测出 3 种Pfcrt 基因型,分别为野生型 C72V73M74N75K76(81.3％,74/91)、突变型 C72V73I74E75T76(12.1％,11/91)和混合型C72V73M/I74N/E75K/T76(6.6％,6/91).测序获得92份恶性疟原虫样品的Pfmdr1基因序列,基因突变率为77.2％(71/92);检测出 3 个突变位点,分别为 N86Y(41.3％,38/92)、Y184F(75.0％,69/92)和 D1246Y(1.1％,1/92),其中 N86Y 突变率从2012年的 68.8％(11/16)下降到 2016年的 11.1％(1/9)(x2=11.58,P＜0.05);检测出5种Pfmdr1基因型,分别为野生型N86Y184D1246(22.8％,21/92),单基因突变型Y86Y184D1246(1.1％,1/92)、N86F184D1246(34.8％,32/92)、N86Y184Y1246(1.1％,1/92)和双重突变型Y86F184D1246(40.2％,37/92).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhfr基因序列,基因突变率为96.7％(87/90);检测出3个突变位点,分别为N51I(91.1％,82/90)、C59R(93.3％,84/90)和S108N(96.7％,87/90);检测出 5种Pfdhfr基因型,分别为野生型N51C59S108(3.3％,3/90),单基因突变型 N51C59N108(2.2％,2/90),双重突变型 I51C59N108(1.1％,2/90)、N51R59N108(3.3％,3/90)和三重突变型I51R59N108(90.0％,81/90).测序获得90份恶性疟原虫样品的Pfdhps基因序列,基因突变率为97.8％(88/90);检测出 6个突变位点,分别为 1431V(8.9％,8/90)、S436A(27.8％,25/90)、A437G(92.2％,83/90)、K540E(3.3％,3/90)、A581G(1.1％,1/90)和 A613S(2.2％,2/90);检测出 8 种Pfdhps基因型,分别为野生型I431S436A437K540A581A613(2.2％,2/90),单基因突变型 I436A436A43(5.6％,5/90)、I431S436G437K540A581A613(66.7％,60/90),双重突变型 I431A436G437K540A581A613(10.0％,9/90)、I431S436G437E540A581A613(3.3％,3/90),三重突变型V431A436G437K540A581A613(8.9％,8/90)、I431A436G437K540G581A613(1.1％,1/90)和 I431A436G437K540A581S613(2.2％,2/90).89份恶性疟原虫样品的Pfdhfr和Pfdhps基因同时测序成功,其中84例(94.4％)同时发生双基因突变,四重突变体I51R59N108-G437占比最高(64.0％,57/89).结论 自赤道几内亚输入的恶性疟原虫样品中检出多个PfKI3基因突变位点,其中M476I和P574L已被证实与青蒿素类药物抗性相关;随着氯喹的停用,与青蒿素配伍药物抗性相关的Pfcrt和Pfmdr1基因突变率呈下降趋势;恶性疟原虫对磺胺多辛-乙胺嘧啶药物抗性水平多为"部分抗性",未检出"超级抗性"样品.

目的 肿瘤细胞产生能力的方式是糖酵解,且糖酵解与恶性肿瘤的发生、发展及转移关系非常密切.本研究的目的是评估甲状腺中糖酵解限速酶6磷酸果糖2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphos-phatase 3,PFKFB3)的表达水平,及其在甲状腺细胞生长、迁移、体内成瘤的影响,以期为甲状腺治疗提供新思路.方法 收集2015-01-01-2016-12-31右江民族医学院附属医院病理科存档蜡块标本28例及11例癌周正常甲状腺组织标本.应用免疫组织化学技术检测甲状腺和正常甲状腺组织中PFKFB3的表达.采用PFKFB3的抑制剂PFK15抑制甲状腺细胞PFKFB3的表达,并观察PFKFB3抑制对甲状腺癌细胞生长、迁移、体内成瘤的影响.结果 免疫组化结果显示,PFKFB3在甲状腺组织中表达阳性率达85.7％(24/28),明显高于正常甲状腺组织中的PFKFB3的18.2％(2/11),F=3.24,P<0.001.蛋白质印迹检测结果同样证实,甲状腺癌组织中PFKFB3蛋白表达水平明显高于正常甲状腺组织.MTT试验表明,与对照组(1.1±0.12)相比,0.25(0.82±0.08)、2.5(0.61±0.16)和5μmol/L(0.15±0.05)PFK15可明显抑制SW579细胞的增殖活性(F值分别为3.47、2.35和3.77,均P<0.05)和增殖相关分子的表达.细胞划痕实验结果显示,刮除细胞24 h后,0.25、2.5和5μmol/L PFK15处理组的SW579细胞向划痕区域迁移,但其划痕区域的细胞数量分别为86±14(F=2.59,P<0.001)、57±12(F=3.52,P<0.001)和46±8(F=2.15,P<0.001),明显少于对照组的102±13.Transwell小室表明,0.25、2.5和5μmol/L PFK15处理组中,穿过基质胶的SW579细胞数量分别为71±6(F=2.35,P<0.001)、58±11(F=3.68,P<0.001)和41±7(F=2.38,P<0.001),明显少于对照组的91±8.裸鼠移植瘤实验结果显示,注射浓度为1〔(661±168)mm3,F=3.42,P<0.01〕和5 mg/kg〔(514±147)mm3,F=2.87,P<0.001)〕组裸鼠的肿瘤体积明显小于对照组的(924±254)mm3,且0.25、2.5和5μmol/L PFK15组肿瘤质量〔(201±74)mg,F=1.27,P>0.05;(142±42)mg,F=3.56,P<0.01;(112±32)mg,F=3.57,P<0.001〕明显小于对照组的(223±87)mg.裸鼠肺转移模型结果显示,0.25、2.5和5μmol/L PFK15组裸鼠肺部转移灶数目〔(12±4)个,F=3.66,P<0.05;(4±3)个,F=2.86,P<0.01;(2±1.5)个,F=3.31,P<0.001〕明显少于对照组的(16±5)个.结论 PFKFB3在甲状腺组织中高表达,且在甲状腺癌的增殖、迁移、侵袭和转移中起重要作用.抑制PFKFB3可作为甲状腺生物治疗的潜在分子靶点.

目的 了解中缅边境地区恶性疟原虫对抗疟药物的敏感性及其抗性相关基因多态性之间的关系,为当地制定合理的疟疾药物策略提供依据. 方法 2009年在缅甸拉咱市农日班诊所设立调查点,选取镜检为单一感染恶性疟原虫,2周内未用过抗疟药、磺胺和四环素类药物的现症患者为调查对象,给药前采集患者全血或滤纸血滴,用于体外药物敏感性测定和基因检测.运用Rieckmann体外微量测定法对恶性疟原虫进行体外青蒿素、氯喹、哌喹和咯萘啶敏感性检测.提取全血或滤纸血滴DNA,进行恶性疟原虫氯喹抗性转运基因(Pfcrt)、多药抗性基因(Pfmdr)和Kelch基因(PfK13)抗性相关基因检测.应用SPSS 23.0软件Spearman秩相关系数检验分析恶性疟原虫药物抗性与其携带基因之间的关系. 结果 共收集镜检为单一感染恶性疟原虫患者血样63份,体外药物敏感测定51例,成功测定42例,占82.4％.恶性疟原虫对氯喹的平均抑制浓度、半数抑制量(ID50)和抗性率较高,分别为880 nmol/L、320.5 nmol/L和95.2％;对咯萘啶平均抑制浓度、青蒿素ID50和哌喹抗性率较低,分别为410 nmol/L、84.8 nmol/L和7.1％.在对氯喹有抗性的40份血样中,对咯萘啶、青蒿素和哌喹的交叉抗性率分别为52.5％ (21/40)、37.5％ (15/40)和7.5％ (3/40);对哌喹有抗性的3份血样中,对氯喹、青蒿素和咯萘啶的交叉抗性率均为3/3.存在交叉抗性的血样从高到低分别为:氯喹与咯萘啶21份,氯喹与青蒿素15份,青蒿素与咯萘啶13份,哌喹与氯喹、青蒿素和咯萘啶均为3份.Spearman秩相关系数检验分析显示,青蒿素与哌喹和咯萘啶的抗性之间均存在相关性(r=0.354、0.446,P＜ 0.05).基因检测结果显示,Pfcrt基因成功测序37份,均为74～～76位点C72V73I74E75T76三重突变基因型,突变率为100％ (37/37).Pfmdr基因在第86和1246位点分别成功测序47和49份血样,突变率分别为N86Y (2.1％,1/47)和D1246Y(100％,49/49).PfK13基因成功测序20份,存在3种基因突变型,其中F446I突变率较高,占50.0％ (10/20),I492L/S和C580Y基因突变率较低,均为5.0％ (1/20).体外药物敏感性检测为抗性的血样中,Pfcrt基因C72V73I74E75T76、Pfcrt基因N86Y1246、PfK13基因I446S492C580和Pfcrt/Pfmdr基因I74E75T76/Y1246基因型频率较高,分别占各自的100％ (37/37)、93.9％ (46/49)、50.0％ (10/20)和69.0％ (29/42).Spearman秩相关系数检验分析显示,Pfcrt、Pfmdr和PfK13基因突变与体外药物敏感性间无相关性. 结论 缅甸拉咱市恶性疟原虫对氯喹已普遍产生了抗性,对咯萘啶和青蒿素具有一定抗性,但对哌喹仍然敏感.

为研究香蕉中MaPFK基因的功能和生物学特性,采用生物信息学分析法对香蕉A基因组的MaPFK基因家族成员进行鉴定、蛋白特性分析、分子进化树分析、FPKM值分析,同时以'天宝蕉'为材料,通过RT-PCR技术克隆MaPFK3基因,进行生物信息学分析;采用qRT-PCR技术进行低温胁迫下的表达分析.结果表明,MaPFK家族包含12个成员,分子进化树分析可分为3类,FPKM值分析表明MaPFK成员在13、4、0℃不同低温胁迫下有不同程度的上调或下调表达.采用RT-PCR技术克隆了MaPFK3,其基因编码区长1 617 bp,预测编码538个氨基酸,MaPFK3编码蛋白属于PFK超家族,是不稳定的酸性亲水蛋白,无信号肽,亚细胞预测定位于细胞质;MaPFK3启动子顺式作用元件预测分析结果显示,MaPFK3启动子含有光响应、激素响应以及与逆境胁迫相关的作用元件.qRT-PCR分析结果显示,香蕉MaPFK3基因的表达具有组织差异性,且表达量为叶片＞假茎＞根;低温胁迫引起'天宝蕉'中MaPFK3基因下调表达,在13、4、0℃不同低温胁迫下,MaPFK3的表达量为13℃＜4℃＜0℃.本研究表明MaPFK基因家族成员能在香蕉应对低温胁迫的过程中发挥着重要作用.

目的 构建恶性疟原虫Kelch 13-F446I(pfK13-F446I)基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中表达.方法 体外合成恶性疟原虫Kelch 13野生型和F446I蛋白结构域片段碱基,定向克隆至转移载体pFastBac,构建pfK13-WT-Bac和pfK13-F446I-Bac质粒,转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞后进行基因重组.提取重组病毒,PCR和Western blot验证后转染草地贪夜蛾细胞(SF9).收集亲代重组病毒反复感染SF9细胞进行病毒扩增,优化可溶性蛋白的纯化条件,采用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达情况.结果 构建了含恶性疟原虫pfK13-F446I基因的重组质粒pfK13-F446I-Bac,大小约3430 bp.转染SF9细胞后获得有感染力的重组杆状病毒,并在SF9细胞中表达pfK13-F446I蛋白,经梯度洗脱、去标签、透析等获得大小为44 ku的单一电泳条带的pfK13-F446I蛋白.结论 成功构建pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中进行成功表达.

目的 调查赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫多药耐药蛋白1(Plasmodium falciparum multidrug resistance protein 1,PfMDRl)、氯喹抗性转运蛋白基因(P.falciparum chloroquine resistant transporter,PfCRT)和Kelch13基因(P.falciparum Kelch 13,PfK13)多态性,为当地疟疾防控策略制定提供参考.方法 采集2018-2019年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫感染者外周血样本85份,提取基因组DNA.采用巢式PCR技术扩增PfMDR1、PfCRT和PfK13基因,对扩增产物进行DNA测序,并对基因序列进行比对.结果 赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfK13基因不存在已知与青蒿素抗性相关的突变;PfMDR1基因和PfCRT基因均存在不同比例抗药性突变,其中PfMDR1_N86Y、PfMDR1_Y184F和PfCRT_K76T突变率分别为35.29％(30/85)、72.94％(62/85)和24.71％(21/85).结论 赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfMDR1、PfCRT基因和PfK13基因均存在不同程度突变.

目的 探讨在晚发型子痫前期(late-onset preeclampsia,LOPE)胎盘氧化应激失衡中,糖代谢来源的抗氧化物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的表达变化.方法 选取重庆医科大学第一附属医院产科于2020年11月–2021年10月行剖宫分娩的LOPE孕妇13例,正常妊娠孕妇13例,分别收集胎盘组织.采用DCFH-DA法测定LOPE孕妇和正常妊娠孕妇胎盘组织活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平.分光光度法测定LOPE组及对照组胎盘组织中NADPH、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、葡萄糖含量,磷酸戊糖代谢途径中关键限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)、磷酸葡萄糖酸脱氢酶(phospho-gluconate dehydrogenase,PGD)的表达及活性水平.应用Western blot方法检测LOPE组及对照组胎盘组织中G6PD、PGD及糖酵解途径关键限速酶磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase-1,PFK1)的蛋白表达变化.结果 LOPE胎盘组织中ROS水平较对照组胎盘升高(P<0.05),抗氧化物质NADPH、GSH以及葡萄糖含量较对照组胎盘组织升高(P<0.05),PFK1蛋白表达在LOPE胎盘中升高(P<0.05),而G6PD、PGD活性及其蛋白表达在LOPE组与对照组中未见明显差异.结论 晚发型子痫前期胎盘组织中葡萄糖发生代谢重编程,是抗氧化物质NADPH、GSH异常升高的原因之一.

目的 观察二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)对糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)的改善效应,并探索其对心肌组织糖代谢的影响及作用机制.方法 利用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导C57BL/6J小鼠建立DCM模型,实验分为对照组(CON)、糖尿病心肌病组(DCM)、糖尿病心肌病加DHM干预组(DCM+DHM),每组15只,干预时间13周.小鼠处死前,检测超声心动图和葡萄糖耐量.处死后,检测心肌组织学(HE、透射电镜、Masson、Sirius Red染色)及血清生化指标,免疫荧光染色和qRT-PCR法检测心肌组织糖吸收和糖酵解相关基因和蛋白的表达水平,RNA-Seq技术检测分析心肌组织差异表达基因及其功能注释.结果 与对照组比较,DCM组小鼠心脏收缩和舒张功能显著降低,心肌组织有炎性细胞浸润,心肌损伤血清学标志物CK、CK-MB、LDH显著升高(P＜0.01),心肌纤维化明显,同时伴有纤维化相关分子TGF-β1、α-SMA、Timp mRNA表达显著升高(P＜0.05,P＜0.01),糖脂代谢指标包括糖耐量、血糖、TC、TG、LDL-C、HDL-C异常(P＜0.05,P＜0.01).DCM组小鼠心肌组织中葡萄糖吸收相关基因GLUT1、GLUT4及糖酵解相关基因HK1、HK2、PFK、LDH、PKM mRNA表达均较对照组显著降低(P＜0.05).DHM干预后,可以显著改善DCM小鼠心功能、心肌纤维化、心肌损伤及糖脂代谢异常,并促进心肌组织葡萄糖吸收与糖酵解相关基因mRNA和蛋白的表达.RNA-seq结果显示,DHM干预后多个代谢调节相关基因表达明显改变,其中差异表达基因NR4A1可能是DHM作用的潜在靶点.结论 DHM改善DCM小鼠的心功能可能与改善心肌糖吸收和糖酵解密切相关.