冠状病毒(Coronavirus, CoV)是一类古老的、广泛存在的、对人类和其他动物健康构成严重威胁的传染病病原体。目前已鉴定能感染人的冠状病毒(human CoV, HCoV)共有7种。已证实：这些可感染人的冠状病毒均为动物源性的人畜共患病原体，通过跨越种间屏障，从自然宿主以直接或间接的方式"跳跃"到人群，并进一步造成人际间的传播和流行。冠状病毒刺突蛋白(Spike, S)S1亚基上的受体结合区(receptor binding domain, RBD)是决定冠状病毒跨种传播、侵入宿主的关键因素之一。本文就近年来7种HCoVs传播路径以及介导跨种传播的RBD结构研究进展进行总结和分析，以期获得对冠状病毒跨种传播机制的认识，为我们应对潜在的新型冠状病毒跨种传播事件，提供有效的防控和治疗策略。

目的:了解不同亚型禽流感病毒与不同动物来源红细胞的凝集特性，为流感环境样本监测工作选择更适宜的检测用红细胞。方法:选取2009-2016年我国禽流感环境监测中分离到的不同亚型的禽流感毒株，采用红细胞凝集试验，选用5种动物红细胞(鸡、火鸡、豚鼠、马和绵羊)进行检测；应用流式细胞仪检测不同动物红细胞表面唾液酸受体的表达及类型，通过氨基酸序列分析病毒血凝素蛋白受体结合区(receptor binding domain, RBD)的特征。结果:本研究共检测了14种亚型的28株禽流感病毒。结果显示所有毒株均能与火鸡和豚鼠红细胞发生凝集，其余红细胞均出现不能与某些毒株产生凝集的现象；其中1株H9N2(A/环境/安徽/43762/2015)毒株与鸡红细胞不产生凝集反应；1株H1N1(A/环境/山东/76972/2014)和2株H9N2(A/环境/重庆/79449/2014和A/环境/安徽/43762/2015)毒株与马红细胞不产生凝集反应；2株H9N2(A/环境/重庆/79449/2014和A/环境/安徽/43762/2015)和2株H13N8(A/环境/青海湖/166/2012和A/环境/青海湖/13/2012)毒株与绵羊红细胞不产生凝集反应。流式检测结果显示在火鸡、鸡和豚鼠红细胞表面可检测到两种类型唾液酸受体α2，3和α2，6，但两种受体表达比例不同；马和绵羊红细胞表面唾液酸受体只检测到表达α2，3。序列分析提示病毒RBD关键区域的氨基酸替换可能是影响病毒红细胞结合特性的重要因素。结论:在禽流感病毒检测中，火鸡和豚鼠红细胞在红细胞凝集试验中敏感性最好。不同来源的红细胞其受体表达及类型会显著影响不同亚型禽流感病毒的凝集反应，同时RBD关键区域的氨基酸变化也会影响病毒与不同红细胞的结合。

目的:构建和鉴定表达新型冠状病毒（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）Omicron株刺突蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）的重组4型腺病毒。方法:使用重叠延伸PCR和无缝克隆构建增强型绿色荧光蛋白和RBD双顺反子表达盒，将PCR得到的ccdB片段和pBR322-Ad4质粒进行同源重组获得中间质粒pBR322-Ad4-ccdB，使用 PacI和 SpeI酶切质粒pBR322-Ad4-ccdB后回收载体片段，回收片段与双顺反子表达盒在 E.coli GB08Red中同源重组获得重组质粒pBR322-Ad4-RBD，用 AsiSI线性化后转染HEK293T细胞获得重组腺病毒Ad4-RBD，RT-PCR验证RBD蛋白的转录，Western blot验证重组腺病毒中RBD蛋白的表达。 结果:重组腺病毒Ad4-RBD的滴度达到5×10 8 PFU/mL，并能在细胞中稳定表达外源基因。 结论:成功构建了表达SARS-CoV-2 Omicron株RBD蛋白的重组4型腺病毒，为SARS-CoV-2 Omicron株疫苗的研发提供了科学有效的依据。

罕见出血疾病（RBD）是指一种或多种凝血因子缺陷引起的单基因遗传性疾病，包括纤维蛋白原（Fg）、凝血酶原、凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅷ的缺陷等。由于RBD极低的流行率以及由此导致的随机对照研究的缺乏，其精准的诊断治疗给临床医生带来极大的挑战。面对其临床表型和实验室特点的异质性，更需要加强临床与实验室的沟通合作，实现综合管理。

探讨伴睡眠周期性肢动（PLM）的帕金森病（PD）患者的临床特点。收集2018年10月至2022年7月在天坛医院进行多导睡眠监测（PSG）的36例PD患者的临床资料，使用帕金森病统一评定量表3.0版和Hoehn-Yahr（H-Y）分期评定PD患者症状严重程度，以睡眠周期性肢动事件指数（PLMSI）15次/h为界分成两组：睡眠周期性肢动（PLMS）+组（PLMSI≥15次/h）、PLMS-组（PLMSI<15次/h）。比较两组之间的临床特点。PLMS+组患者15例（42%），PLMS-组患者21例（58%），其中PLMS+组患者伴有快速眼动睡眠障碍（RBD）为12例（12/15），PLMS-组患者伴有快速眼动睡眠障碍为9例（42.9%），PLMS+组合并RBD比率高于PLMS-组（ P<0.05）。两组患者的血液叶酸含量［ M（ Q1， Q3），PLMS-组6.20（5.14，11.70）ng/ml，PLMS+组4.41（3.07，5.64）ng/ml）］比较差异有统计学意义（ P<0.01），PLMS+组患者更多见叶酸缺乏；而同型半胱氨酸及铁蛋白含量比较差异无统计学意义（均 P>0.05）。4/15的PLMS+组患者有跌倒经历，而PLMS-组发生跌倒的患者比例为14.3%（3/21），PLMS+组患者更容易出现跌倒。PLMS+组患者PSG的觉醒指数［ M（ Q1， Q3），21.50（19.35，29.90）次/h］高于PLMS-组［11.90（9.10，15.80）次/h］（ P<0.05）；两组间其他睡眠参数差异无统计学意义（均 P>0.05），其中两组患者呼吸暂停低通气指数（AHI）均高于正常值（<5次/h），其中PLMS-组AHI为［ M（ Q1， Q3）］9.80（4.70，22.20）次/h，PLMS+组为8.20（1.70，11.15）次/h，提示PD患者更容易出现睡眠中的呼吸暂停和低通气现象。PD-PLMS+组患者常合并叶酸缺乏，更加容易发生跌倒；伴周期性肢动的PD患者存在睡眠觉醒指数高，睡眠碎片化程度高，RBD患病率更高。

目的:分析帕金森病（PD）和多系统萎缩（MSA）患者红细胞中的α-突触核蛋白寡聚体（RBC-O-α-Syn）含量及其与临床症状的相关性。方法:收集2020年7月至2021年10月从首都医科大学宣武医院功能神经外科、神经内科招募的PD患者296例，MSA患者85例，同期从北京老年纵向研究社区队列招募健康对照（HC）受试者403名。ELISA测试RBC-O-α-Syn含量。单变量线性回归模型分析各种运动和非运动评分，如帕金森病统一评定量表（UPDRS）Ⅲ、多系统萎缩统一评定量表（UMSARS）Ⅲ、简易智力状态检查量表（MMSE）、快速眼动睡眠行为障碍-香港（RBDQ-HK）及蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分与RBC-O-α-Syn含量的相关性。受试者工作特征（ROC）曲线评估RBC-O-α-Syn区分PD、MSA患者和HC受试者的特异度、灵敏度和曲线下面积（AUC）。结果:HC组受试者年龄（70±8）岁；PD患者年龄（64±9）岁，其中，震颤为主型PD（TD-PD）115例（38.9%），姿势不稳步态障碍为主型PD（PIGD-PD）132例（44.6%），H-Y分期为2期的患者142例（48.0%）。UPDRS Ⅲ评分为（31.2±17.8）分；MSA患者年龄（64±9）岁，UMSARS Ⅱ评分（18.9±10.3）分。PD和MSA患者的各种非运动症状与HC受试者的差异均有统计学意义（均 P<0.001）。PD组患者和MSA组患者RBC-O-α-Syn含量［（50±17）、（52±19）ng/mg］明显高于HC组受试者［（21±10）ng/mg］（均 P<0.001）。RBC-O-α-Syn区分PD患者和HC受试者的灵敏度和特异度分别为87.16%（95% CI：82.87%~90.50%）和86.10%（95% CI：82.38%~89.14%），AUC为0.933（95% CI：0.914~0.951），区分MSA患者和HC受试者的灵敏度和特异度分别为85.88%（95% CI：76.93%~91.74%）和81.39%（95% CI：77.30%~84.89%），AUC为0.921（95% CI：0.884~0.957）。PD患者伴随快速眼动睡眠行为障碍（RBD）者的RBC-O-α-Syn含量高于不伴RBD者［（53±16）比（48±17）ng/mg， P=0.029］。MSA患者伴随RBD者的RBC-O-α-Syn含量与不伴随RBD者的差异无统计学意义［（56±17）ng/mg 比（48±20）ng/mg， P=0.070］。RBC-O-α-Syn含量在女性PD患者和HC受试者中高于男性，但在不同年龄和病程的受试者之间差异无统计学意义（ P>0.05）。此外，RBC-O-α-Syn含量与UPDRS Ⅲ（ r=0.18， P=0.002）、快速眼动睡眠行为障碍问卷-香港（RBDQ-HK）分数（ r=0.19， P<0.001）呈正相关，但与H-Y分期、非运动症状量表（NMSS）、MMSE、MoCA、汉密尔顿抑郁量表（HAMD）、汉密尔顿焦虑量表（HAMA）分数无相关性（均 P>0.05）。MSA患者的RBC-O-α-Syn含量与UMSARS Ⅱ以及NMSS、MMSE、MoCA、HAMD、HAMA均无相关性（均 P>0.05）。 结论:PD和MSA患者RBC-O-α-Syn含量显著增高，PD患者RBC-O-α-Syn含量与UPDRS Ⅲ和RBDQ-HK分数呈正相关。

目的:探索原核表达新型冠状病毒受体结合蛋白（RBD）的制备方法，并对其在小鼠体内的免疫原性进行评价。方法:用大肠埃希菌表达重组新型冠状病毒RBD，进行纯化、透析复性，比较了RBD复性前后的结构表征和抗原活性变化，最后将制备所得重组RBD免疫Babl/c小鼠，检测免疫小鼠体内的体液免疫和细胞免疫变化情况。结果:完成了大肠埃希菌表达的新型冠状病毒重组RBD的制备。复性前后，RBD的自发荧光波长发生蓝移现象，从（363.33±0.47）nm蓝移至（333.00±0.82）nm，蛋白形状从无序状态折叠为（9.55±0.39）nm的颗粒，复性后RBD与ACE-2的结合活性是复性前的128倍。活病毒中和抗体检测结果显示：血清对原型株的滴度几何平均数为136.70，对贝塔株为101.59，两者无统计学差异( t=0.41， P=0.700)。试验组小鼠脾淋巴细胞产生的分泌特异性IFN-γ的效应T细胞为(308.50±144.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞，低于对照组[(3.75±3.11)个斑点形成细胞/5×10 5个细胞]，差异有统计学差异( t=4.72， P=0.010)。 结论:成功制备原核表达的新型冠状病毒重组RBD，通过体外复性折叠，能够产生良好、全面的免疫原性。

目的:研究新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针的效果。方法:选择新型冠状病毒受体结合域(receptor binding domain，RBD)进行3次重复拷贝串联作为免疫原(RBD-sc-trimer)，利用昆虫杆状病毒表达系统表达RBD-sc-trimer重组蛋白，并用His-标签亲和纯化。纯化产物进行Western blot鉴定并在体外验证其与人血管紧张素转化酶2(human angiotensin converting enzyme 2, hACE2)的结合能力。在BALB/c小鼠模型中进行免疫原性检测(结合抗体及中和抗体)，同时与RBD二聚体(RBD-Fc)、RBD单体(RBD)和刺突蛋白三聚体(S trimer)进行比较。结果:RBD-sc-trimer的免疫原性优于RBD-Fc和RBD，并能达到S trimer的水平。RBD-sc-trimer能诱导产生较强的Th1偏向型抗体应答，并能交叉中和新型冠状病毒Beta、Delta和Omicron变异株，其中相较于原始毒株，针对Omicron的中和抗体水平仅下降9.1倍，远低于RBD-Fc(68.4倍)和S trimer(70.8倍)组的下降水平。结论:本研究制备的新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针可以诱导较强以及更为广谱的体液应答，能更好地应对变异株，具有较好的研发与应用前景。

目的:利用毕赤酵母高效表达新型冠状病毒刺突蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)，并评估以该RBD蛋白作为抗原所制备的疫苗组合物的免疫原性。方法:选取RBD蛋白并合成对应基因片段，将其构建至pPICZαA质粒，质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达。Western blot和基于BLI(Biolayer Interferometry)技术的定量分析方法对培养上清中RBD蛋白进行检测，筛选能够分泌表达RBD蛋白的单克隆菌株。通过优化发酵工艺，包括培养基的盐浓度调整和诱导条件优化(pH、温度和时间等参数)，实现RBD蛋白的高效表达，并在小鼠体内评估其免疫原性。结果:筛选获得重组RBD蛋白表达效果较好的RBD-X33单克隆菌株。通过优化后的发酵工艺，即采用HBSM培养基、诱导pH为6.5±0.3、诱导温度为22℃、诱导时间持续120 h，实现发酵收获上清中重组RBD的表达量达到240 mg/L。在小鼠免疫原性试验中，采用铝+CpG双佐剂系统吸附重组RBD蛋白的疫苗组合物能够激发小鼠产生2.7×10 6结合抗体滴度和726.8活病毒(野生型)中和抗体滴度。 结论:采用毕赤酵母表达系统能够高效表达重组RBD蛋白，且所表达的RBD蛋白能够有效激发动物产生免疫应答。本研究为基于RBD蛋白的重组新型冠状病毒疫苗的开发提供了参考。

目的:利用原核表达系统制备针对新型冠状病毒BA.2变异株亚单位疫苗并评价其免疫原性。方法:利用分子克隆技术同时构建BA.2变异株RBD以及RBD与TT-P2表位串联的重组质粒，通过蛋白纯化技术获得重组蛋白So和Sot。蛋白So/Sot作为免疫原与Al(OH) 3佐剂混匀后对小鼠进行肌肉注射免疫以评价细胞和体液免疫效果。 结果:原核系统成功表达目的蛋白且透析复性后获得高纯度可溶性蛋白。Sot组分泌IFN-γ和IL-4的抗原特异性T淋巴细胞数(213.7±0.6和311.7±1.5)均显著高于So组(94.3±16.8和185.7±4.2)( P<0.001)。Sot组诱导小鼠产生的血清抗体水平高于So组，针对BA.2毒株的中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)分别为588和337( P<0.05)。Sot蛋白能诱导产生Th1/Th2混合型免疫应答但以Th2型为主。 结论:原核系统表达的蛋白亚单位疫苗具有良好的细胞和体液免疫原性，为新冠病毒Omicron变异株蛋白亚单位疫苗的研发提供了有力的理论依据。