目的:探讨腹腔镜辅助多西环素注射治疗在巨大腹膜后淋巴管畸形(retroperitoneal lymphatic malformation，rLM)中的应用效果。方法:回顾性分析2020年7月至2021年7月上海市儿童医院普外科采用腹腔镜辅助多西环素注射治疗的3例巨大rLM患儿临床资料，总结患儿治疗次数及结局，并进行相关文献复习。结果:3例中男1例，女2例；年龄2岁2个月至5岁8个月；2例表现为腹痛及腹股沟肿块，1例于体检过程中被发现。3例共进行了5次注射治疗，其中2例治疗2次。病例1治疗后病变最大长径由14.7 cm缩小至4.0 cm，体积缩小约95.2%；病例2治疗后病变最大长径由11.8 cm缩小至5.5 cm，体积缩小约95%；病例3治疗后病变最大长径由9.0 cm缩小至2.5 cm，体积缩小约98.9%。3例均达到治愈标准且症状消失。1例术后出现呕吐，自行缓解。随访6～12个月未见复发及其他并发症。结论:多西环素注射治疗巨大rLM疗效显著，安全性高，可作为临床治疗rLM的优先选择。腹腔镜辅助下治疗巨大rLM创伤小，可提高注射精准度，减少并发症的发生。

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA 连接酶介导的 cDNA 末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白.同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和 909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株.结果表明,最适筛选压力为 20P200M(一轮加压)和 50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为 1 620 mg/L和 623 mg/L.本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础.

目的:以胆红素代谢过程中UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1酶)介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点,考察何首乌中二蒽酮及蒽酮糖苷成分的肝毒性.方法:以胆红素为UGT1A1酶底物,以表现抑制常数Ki为评价指标,采用体外大鼠肝微粒体孵育法测定待测单体成分肝毒性有无及大小,并寻找构效关系.结果:待测单体成分在大鼠肝微粒体(RLM)体系中对UGT1A1酶的抑制由强至弱的顺序为:顺式-大黄素-大黄素二蒽酮(强抑制),反式-大黄素-大黄素二蒽酮(强抑制),polygonumnolide C2(强抑制),polygonumnolide C3(中等强度抑制),polygonumnolide C4(弱抑制),且存在构效关系,推测6(6 ')-羟基为活性必需基团,其空间暴露程度可影响其与UGT1A1酶的结合,导致不同程度的抑制作用.结论:本实验初步探讨了何首乌中二蒽酮类成分潜在肝毒性的作用机理,为研究毒性中药提供了新的思路.

目的 以胆红素代谢过程中UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1酶)介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点,考察何首乌中8种单体成分肝毒性.方法 以胆红素为UGT1A1酶底物,以表观抑制常数Ki为评价指标,采用体外大鼠肝微粒体孵育法测定待测单体成分肝毒性有无及大小,并寻找构效关系.结果 8种待测单体成分在大鼠肝微粒体(RLM)体系中对UGT1A1酶的抑制情况分别为:大黄素-8-O-葡萄糖苷(中等强度抑制)＞大黄素(中等强度抑制)＞羟基大黄素(中等强度抑制)＞儿茶素(弱抑制)＞没食子酸(无抑制)＞大黄素甲醚(无抑制)＞大黄酸(无抑制)＞大黄素-6-O-葡萄糖苷(无抑制).且存在构效关系,推测6位羟基为活性必需基团.结论 本实验所建立的体外研究方法稳定可行.实验结果证明,酶抑制作用存在一定的结构选择性,为预测同类结构对酶活性作用提供实验基础.

3-脱氢奎尼酸脱水酶/莽草酸脱氢酶(DHD/SDH)是茶树莽草酸途径中唯一的双功能酶,一方面催化生成莽草酸,另一方面可以催化生成没食子酸. 为研究DHD/SDH基因在茶树代谢途径中表达及调控模式,通过在线预测、RLM-RACE和qPCR技术探讨miRNA对DHD/SDH的调控及表达模式. 在获得的茶树miRNA序列的基础上,对本试验室克隆得到的茶树3个DHD/SDH进行 miRNA预测和鉴定. 获得了4个miRNA参与裂解CsDHD/SDH基因. 其中miR5180b、miR1510b-5p和miR24共同靶向CsDHD/SDH2,miR868-5p作用于CsDHD/SDH3. 同时对茶树中3个CsDHD/SDH表达模式进行检测. 不同激素处理下,CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3表达模式一致. CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3的表达模式存在协同作用. 本研究表明CsDHD/SDH1与CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3之间的表达存在负反馈调节, CsDHD/SDH1上调表达时会导致互补基因CsDHD/SDH2和CsDHD/SDH3下调表达. (图4表2参2 5)

本研究以水蜜桃品种‘小白凤’为试材,利用miR-RACE技术验证了桃miR393b的精确序列,克隆得到了其靶基因生长素受体Pp TIR1的ORF序列.利用RLM-RACE技术以及qRT-PCR方法对Ppe-miR393b作用于靶基因Pp TIR1的作用模式及作用频度进行了分析.结果表明,Ppe-miR393b的精确序列与预测序列在5'端存在1个碱基的差异,其靶基因Pp TIR1编码584个氨基酸且N端含有1个高度保守的FBOX DNA结合域.RLM-5'RACE结果显示,Ppe-miR393b以裂解的方式作用于其靶基因Pp TIR1,且在Ppe-miR393b 5’端的第10和11位碱基之间以及第8和9位碱基间均存在裂解位点,但前者的裂解频度显著高于后者.以上结果表明Ppe-miR393b通过介导靶基因Pp TIR1的裂解参与生长素信号途径.

Grain weight and grain number are two important traits directly determining grain yield in rice.To date,a lot of genes related to grain weight and grain number have been identified;however,the regulatory mechanism underlying these genes remains largely unknown.In this study,we studied the biological function of OsSPL18 during grain and panicle development in rice.Knockout (KO) mutants of OsSPL18 exhibited reduced grain width and thickness,panicle length and grain number,but increased tiller number.Cytological analysis showed that OsSPL18 regulates the development of spikelet hulls by affecting cell proliferation.qRT-PCR and GUS staining analyses showed that OsSPL18 was highly expressed in developing young panicles and young spikelet hulls,in agreement with its function in regulating grain and panicle development.Transcriptional activation experiments indicated that OsSPL18 is a functional transcription factor with activation domains in both the N-terminus and C-terminus,and both activation domains are indispensable for its biological functions.Quantitative expression analysis showed that DEP1,a major grain number regulator,was significantly down-regulated in OsSPL18 KO lines.Both yeast one-hybrid and dual-luciferase (LUC) assays showed that OsSPL18 could bind to the DEP1 promoter,suggesting that OsSPL 18 regulates panicle development by positively regulating the expression of DEP1.Sequence analysis showed that OsSPL18 contains the OsmiR156k complementary sequence in the third exon;5'RLM-RACE experiments indicated that OsSPL18 could be cleaved by OsmiR156k.Taken together,our results uncovered a new OsmiR156k-OsSPL18-DEP1 pathway regulating grain number in rice.

目的 基于UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGT1A1)介导的胆红素代谢,构建UGT1A1酶蛋白模型,用于研究何首乌中潜在致肝毒性成分的毒性作用,并用体外大鼠肝微粒体抑制实验进行验证.方法 采用同源模建方法构建UGT1A1酶蛋白结构,将UGT1A1底物胆红素及何首乌中主要蒽醌类成分大黄素、大黄酚、大黄酸、羟基大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚与UGT1A1蛋白进行分子对接,考察分子结合靶点及结合强弱.采用大鼠肝微粒体孵育体系(RLM),加入系列浓度的底物胆红素对照品溶液及待测单体对照品溶液,检测表观抑制常数(Ki),测定蒽醌类单体成分对UGT1A1酶的抑制作用.结果 分子对接结果显示,UGT1A1酶蛋白结构上共有9个活性口袋区,胆红素的结合口袋确定为位点F;6个单体主要集中在两个活性口袋区:大黄素、羟基大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄酚对接进入位点F;大黄素甲醚和大黄酸对接进入位点C.结合于UGT1A1酶蛋白位点C中的单体大黄酸和大黄素甲醚的结合自由能(IE)值较小;位点F区中,单体大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素及羟基大黄素具有较高的IE值,结合能力强.体外抑制实验显示,大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素表现为较强的竞争型抑制作用,羟基大黄素为较强的混合型抑制作用,与分子对接结果一致.结论 大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、羟基大黄素、大黄素对UGT1A1酶介导的胆红素代谢产生较强的抑制作用,构建的UGT1A1酶蛋白模型可有效预测药物的潜在风险.

啤酒酵母的自溶会严重影响啤酒的品质,而酵母的质量也被认为是啤酒酿造的关键因素之一.前期在啤酒酵母自溶的研究中发现细胞完整性途径中重要的转录因子RLM1基因与酵母自溶有密切关系.本研究在啤酒酵母单倍体菌株中对RLM1进行敲除与过表达,发现RLM1敲除后,酵母菌抗自溶性能差,而RLM1过表达则有助于酵母的抗自溶.另外,发现RLM1基因的敲除影响了酵母的抗渗透压性能、细胞壁损伤的耐受性、抗氮饥饿性能和温度耐受性.研究发现细胞壁组装及DNA损伤应答相关基因GAS1的表达随RLM1的过表达与敲除而调整,而CWI途径中其他相关基因的调控方式并没有明显的规律,推测RLM1可能主要影响了CWI途径中GAS1基因的表达,进而提高啤酒酵母在恶劣环境中的抗逆性.此研究结果对于进一步选育抗自溶啤酒酵母以及了解啤酒酵母的自溶机制提供了基础.

长非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200 nt、不能编码蛋白质的RNA分子,可通过AMPK、胰岛素受体等多种信号通路,调节细胞糖脂代谢.本研究发现,HepG2细胞中一条未报道的长链非编码RNA,命名为lnc-RLM(lnc-regulate lipid metabolism).通过敲低HepG2细胞中lnc-RLM,检测细胞中甘油三脂含量及脂质代谢相关调节因子表达量.结果 显示,实验组较对照组甘油三酯含量显著升高(P＜0.05);AMPK磷酸化水平显著下调,脂质合成相关因子SREBP 1c和FAS表达量上调;同时,细胞中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)活性较对照组显著上调(P＜0.05).在lnc-RLM敲低的HepG2细胞中,利用AMPK激动剂(A-769662)作用细胞24 h,结果显示,降低的AMPK磷酸化水平并不会因AMPK激动剂的作用而显著升高.本研究结果说明,HepG2细胞中敲低lnc-RLM表达量,可通过影响AMPK磷酸化水平,调节HepG2细胞中脂质沉积.这为今后研究AMPK活性调节提供新的可能,也为代谢性疾病的治疗提供了新思路.