目的:采用mRNA高通量测序技术筛选高磷诱导下肢血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化差异表达基因(DEGs),分析VSMCs钙化的关键基因及信号通路.方法:将人VSMCs分为对照组和模型组,模型组细胞中加入高磷培养基,对照组细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基于相同条件下培养.调整 2组稳定转染VSMCs的状态,培养 12 d,倒置显微镜下观察细胞形态表现并拍照.采用Hisat2软件筛选DEGs,采用Stringtie软件从生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)3个方面进行基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析.Von Kossa染色法观察各组细胞钙化情况,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组细胞中碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肿瘤蛋白53(Tp53)、谷胱甘肽过氧化物酶 4(GPX4)、铁蛋白轻链 1(Ftl1)和糖基磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D1(GPLD1)mRNA表达水平.结果:与对照组比较,模型组共2 524个DEGs,其中1 368个DEGs表达上调,1 156个DEGs表达下调;2组细胞DEGs聚类分离明显.GO功能和KEGG信号通路富集分析表达上调的DEGs主要参与微管细胞骨架组织的调节、细胞极性、蛋白质定位和细胞周期调控等BP,构建细胞膜部分、微管组织、染色体和着丝粒区等CC,发挥与磷脂酰肌醇磷酸盐、Rho鸟苷酸三磷酸酶(GTPase)蛋白结合、参与跨膜转运和调节蛋白激酶活性等MF;表达下调的DEGs主要参与细胞质翻译、蛋白质膜定位、mRNA代谢和蛋白质内质网定位等BP,构建核糖体亚单位、细胞膜和自噬体等CC,发挥与单链DNA、核糖核蛋白复合物、生长因子结合、调节蛋白激酶活性和催化作用等MF.差异表达上调的基因富集7条信号通路,其中最为显著的是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的生物合成;差异表达下调的基因富集 18条信号通路,其中最为显著的是铁死亡.RT-qPCR法,与对照组比较,模型组细胞中GPX4、Ftl1和Tp53 mRNA表达水平明显降低(P<0.01),GPLD1 mRNA表达水平明显升高(P<0.01);与对照组比较,模型组细胞中α-SMA mRNA表达水平明显降低(P<0.01),ALP和BMP2 mRNA表达水平明显升高(P<0.01).结论:钙化的VSMCs与正常细胞存在DEGs,铁死亡和GPI锚定的生物合成信号途径是高磷诱导下肢VSMCs钙化的关键信号通路,主要由GPX4、Ftl1、Tp53和GPLD1共同介导完成.

以Ras 同源基因家族成员C(Ras homolog gene family member C,RhoC)为靶点探讨栓菌酸(trametenolic acid,TA)对人肝癌HepG2.2.15 细胞迁移侵袭的影响及机制,为栓菌酸的利用提供依据.采用MTT法检测TA对HepG2.2.15 细胞增殖的影响;划痕实验、Transwell实验检测TA对细胞迁移、侵袭的影响;pull down实验检测TA对Ras相似物GTP 酶(Ras homo-logue GTPases,Rho GTPases)活性的影响;Western blot实验检测TA对RhoC从胞质到胞膜转运及对RhoC/Rho相关激酶 1(Rho-associated kinase 1,ROCK1)/肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)/基质金属蛋白酶 2(matrix metalloprotease 2,MMP2)/基质金属蛋白酶 9(matrix metalloprotease 9,MMP9)通路相关蛋白表达的影响;采用瞬时质粒转染过表达pcDNA3.1-RhoC,激光共聚焦检测细胞骨架中F-actin的变化,并检测细胞迁移侵袭及RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9 通路相关蛋白表达的变化,以及RhoC GTP酶活性;建立BALB/c 裸鼠皮下移植瘤模型,以索拉菲尼为阳性对照(Sora 20 mg·kg-1),测量TA低、中、高剂量组(40、80、120 mg·kg-1)瘤体积和质量,瘤组织通过Western blot检测相关蛋白的表达.结果显示,TA呈浓度依赖性抑制HepG2.2.15 细胞增殖,24、48 h的IC50 分别为 66.65、23.09 μmol·L-1.裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积均显著降低,索拉菲尼,TA低、中、高剂量组的抑瘤率分别为 62.23%、26.48%、55.45%、62.36%.TA能显著降低HepG2.2.15 细胞迁移侵袭数,且呈浓度依赖性抑制RhoC蛋白的表达及RhoC GTP酶活性,使膜组分RhoC显著下调,减少膜结合RhoC GTP 酶的量.体内外实验证实,TA可显著抑制RhoC下游ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9 蛋白表达.HepG2.2.15 细胞转染pcDNA3.1-RhoC过表达RhoC后,TA能有效抑制过表达后RhoC、ROCK1、MLC、p-MLC、MMP2、MMP9 蛋白的表达水平,及RhoC GTP酶的活性,与过表达前相对抑制水平相似.综上所述,TA可抑制人肝癌HepG2.2.15 细胞迁移侵袭,其机制可能是通过靶向抑制RhoC GTP酶的活性,下调RhoC表达,从而抑制RhoC/ROCK1/MLC/MMP2/MMP9 信号通路.该研究为利用中药有效成分多靶点优势,开发以热休克蛋白 90α(heat shock protein 90α,HSP90α)为靶点的自噬调节剂,达到阻滞肝癌细胞增殖,同时抑制肝癌细胞的侵袭和转移双重作用提供了新思路和方法.

目的 探讨双联抗血小板聚集治疗不同Rho激酶活性的急性冠状动脉综合征(ACS)患者心脏结构和功能变化情况.方法 选取2015年3月~2016年2月于十堰市太和医院接受治疗的ACS患者150例,根据ACS患者的Rho激酶活性(界值为2.45,<2.45为低活性组,≥2.45为高活性组)的高低分为高活性组和低活性组,给予阿司匹林加氯吡格雷治疗.观察比较两组患者入院时以及给予阿司匹林加氯吡格雷治疗后3个月和12个月Rho激酶活性,并评估N-末端脑钠肽前体(NT-proBNP)变化情况以及与左心结构、功能,包括左房内径(LAD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)和心脏指数(CI),对比心血管不良事件发生率.结果 高活性组入院时、治疗后3个月、12个月RHO激酶活性和NT-proBNP水平明显高于低活性组,差异有统计学意义(P均<0.05);两组入院时的LAD、LVEDD、LVEF和CI比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗后3个月、12个月时,高活性组患者的LAD以及LVEDD明显高于低活性组,LVEF和CI低于低活性组,差异有统计学意义(P均<0.05);高活性组患者入院时、治疗后3个月、12个月高敏C反应蛋白水平高于低活性组患者(P<0.05).高活性组患者治疗后不良心血管事件发生率为30.77%,高于低活性组6.94%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 双联抗血小板聚集治疗Rho激酶活性较低的ACS患者效果优于活性较高的患者.

目的 探讨不同剂量阿托伐他汀对冠心病病人Rho激酶活性和内皮功能的影响.方法 选取68例冠心病病人,按随机双盲原则分为阿托伐他汀低剂量组(20 mg/d)和高剂量组(40 mg/d),观察并比较两组病人血脂水平、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、Rho激酶活性、肱动脉血流介导的舒张功能(FMD)及主要不良心脏事件(MACE).结果 高剂量组总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、hs-CRP、Rho激酶活性及MACE发生率明显降低,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及FMD明显增高,与20 mg/d组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 40 mg/d剂量阿托伐他汀治疗冠心痛疗效优于20 mg/d剂量.

目的 探讨辛伐他汀联合银杏叶片对老年冠心病病人小动脉弹性及Rho激酶活性的影响.方法 选择2012年-2016年我院收治的老年冠心病病人84例,随机分为观察组与对照组,每组42例.对照组采用银杏叶片治疗,观察组采用辛伐他汀联合银杏叶片治疗,两组疗程均为3个月.观察两组血脂及心电图改善情况,比较两组病人治疗前后小动脉弹性指数(C2)、Rho激酶活性及超敏C反应蛋白(hs-CRP).结果 观察组血脂改善总有效率(92.86％)高于对照组(76.19％),差异有统计学意义(P＜0.05);观察组心电图改善总有效率(95.23％)高于对照组(73.81％),差异有统计学意义(P＜0.05).治疗后两组病人小动脉弹性均有所改善,但是观察组改善程度明显优于对照组;治疗后对照组Rho激酶活性、hs-CRP与治疗前比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后观察组Rho激酶活性、hs-CRP较治疗前明显降低(P＜0.05);观察组治疗后Rho激酶活性、hs-CRP明显低于对照组(P＜0.05).结论 辛伐他汀联合银杏叶片治疗老年冠心病效果显著,能改善病人小动脉弹性,抑制Rho激酶的活性.

目的 探讨糖尿病合并肺结核患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性变化及其临床意义.方法 选取2015年1月—2017年1月我院收治的150例糖尿病合并肺结核患者(糖尿病合并肺结核组)和100例糖尿病患者(记为糖尿病组)及同期于我院体检的100例健康志愿者(记为健康组)为研究对象,外周血采集采用RosettSep T细胞提取试剂盒,磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)蛋白表达T细胞中Rho激酶活性,免疫印迹法检测三组MYPT1蛋白表达量,酶联免疫吸附检测法(ELISA)检测三组细胞因子[白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)]水平,比较三组胰岛β细胞功能[β细胞功能指数(HOMA-β)、胰岛素抵抗指数(HO-MA-IR)],并分析IL-6、IL-10、HOMA-β、HOMA-IR与T淋巴细胞Rho激酶活性的关系.结果 糖尿病合并肺结核组外周血T细胞Rho激酶活性较糖尿病组、健康组明显高,糖尿病组外周血T细胞Rho激酶活性较健康组明显高,各组之间两两比较有统计学意义(P<0.05);糖尿病合并肺结核组IL-6、IL-10较糖尿病组、健康组明显高,差异显著(P<0.05),但糖尿病组IL-6、IL-10与健康组相较无显著差异(P>0.05);糖尿病合并肺结核组HOMA-β最低、HOMA-IR最高,糖尿病组次之,健康组HOMA-β最高、HOMA-IR最低,三组之间两两比较有统计学意义(P<0.05);IL-6、HOMA-IR与T淋巴细胞Rho激酶活性呈明显正相关,HOMA-β与T淋巴细胞Rho激酶活性呈明显负相关(均P<0.05);但IL-10与T淋巴细胞Rho激酶活性无明显相关性(P>0.05).结论 糖尿病合并肺结核患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性较高,存在炎性因子高表达和胰岛β细胞功能异常现象,可为临床新型靶向药物研究提供理论依据.

瞬时受体电位香草酸受体4(TRPV4)是一种非选择性阳离子通道,能够调控细胞的增殖、凋亡、迁移等.TRPV4在乳腺癌组织中的表达存在分子分型差异.高表达的TRPV4可促进乳腺癌细胞的转移. TRPV4在乳腺癌血管内皮细胞中高表达,可通过维持Rho/Rho激酶活性的最佳水平促进肿瘤血管新生.

目的 探讨miR-335调控Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(ROCK1)对宫颈癌细胞侵袭、迁移的影响.方法 选取人正常宫颈细胞系Ect1/E6E7、宫颈癌细胞系SiHa,分别转染miR-335 mimic、miR-335inhibitor、control mimic及control inhibitor,采用RT-PCR检测miR-335表达,Western blot检测ROCK1蛋白表达,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性.结果 与Ect1/E6E7细胞相比较,在SiHa中miR-335表达显著降低,ROCK1蛋白表达显著增高(P＜0.05).转染miR-335mimic后SiHa细胞中miR-335表达显著增高,ROCK1蛋白表达显著降低(P＜0.05);转染miR-335 inhibitor后SiHa细胞中miR-335表达显著降低,ROCK1蛋白表达显著增高(P＜0.05).转染miR-335mimic后SiHa细胞侵袭、迁移能力显著降低,而转染miR-335 inhibitor后则显著增高(P＜0.05).与转染controlmimic相比,共转染miR-335 mimic与野生型ROCK1-WT可使SiHa荧光素酶活性及ROCK1mRNA明显降低(P＜0.05).结论 miR-335可抑制宫颈癌细胞侵袭及迁移,可能通过调控ROCK1发挥作用.

目的 探讨2型糖尿病并肺结核患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性变化及其临床意义.方法 选取2型糖尿病并肺结核120例(糖尿病并肺结核组)、单纯2型糖尿病80例(糖尿病组)以及同期行健康体检的健康体检者90例(健康对照组)作为研究对象.检测比较3组外周血T淋巴细胞Rho激酶活性、外周血白细胞介素(IL)-6及IL-10水平、稳态模型胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)及稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),分析2型糖尿病并肺结核患者外周血IL-6、IL-10水平及HOMA-β、HOMA-IR与T淋巴细胞Rho激酶活性的关系.结果 3组外周血T淋巴细胞Rho激酶活性、外周血IL-6及IL-10水平、HOMA-β 及HOMA-IR总体比较差异有统计学意义(P<0.05).外周血T淋巴细胞Rho激酶活性糖尿病并肺结核组最高,糖尿病组次之,健康对照组最低,各组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05).糖尿病并肺结核组外周血IL-6及IL-10水平较糖尿病组、健康对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05).糖尿病并肺结核组HOMA-β低于糖尿病组和健康对照组,HOMA-IR高于糖尿病组和健康对照组;糖尿病组HOMA-β低于健康对照组,HOMA-IR高于健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.05).Spearman相关分析显示,2型糖尿病并肺结核患者外周血IL-6水平及HOMA-IR与T淋巴细胞Rho激酶活性呈正相关,HOMA-β与T淋巴细胞Rho激酶活性呈负相关.结论 2型糖尿病并肺结核患者外周血T淋巴细胞Rho激酶活性升高,存在炎性因子高表达和胰岛β细胞功能异常现象,为糖尿病引发肺结核的可能机制.

目的 研究法舒地尔对急性乙酰甲胺磷中毒后乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的影响及其可能的作用机制.方法 SD雄性大鼠共72只,随机分为12组(n=6):生理盐水对照组(A组)、中毒组(B组)、常规治疗组(按采集标本时间顺序依次为C1、C6、C12、C24、C48组)和法舒地尔联合常规治疗组(按采集标本时间顺序依次为F1、F6、F12、F24、F48组),生理盐水组腹腔注射0.9％氯化钠溶液,其余11组,每只大鼠予以等容积30 mg/kg的乙酰甲胺磷腹腔注射建立中毒模型,C组在中毒后予以肌注阿托品(10 mg/kg)及解磷定(20 mg/kg)治疗,F组予以肌注阿托品(10mg/kg)、解磷定(20 mg/kg)及腹腔注射法舒地尔(10 mg/kg)治疗,分别于中毒后1、6、12、24及48h取全血及左室部分组织,采用HE染色方法观察心肌组织的损伤情况,ELISA测定血清AchE水平,免疫印迹测定Bcl-2、Bax进行比较.结果 C、F组的生存率较B组明显提高,F组生存率较C组明显提高,差异均有统计学意义(P＜0.05);C、F组血清AchE水平明显高于B组,差异均有统计学意义(P＜0.05).F组血清AchE水平明显高于C组;C组血清Bax/Bcl-2均在12 h达到峰值,AchE水平在6h达到峰值,F组血清Bax/Bcl-2在6h达到峰值,AchE水平在12 h达到峰值.结论 法舒地尔通过抑制Rho激酶活性一定程度上解除血清中的AchE抑制,并使AchE水平高峰前移,进而降低乙酰胆碱(Ach)蓄积对心肌的损害作用.